傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）環(huán)指蛋白功能研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)是一種虹彩病毒,近年在廣東地區(qū)流行,導(dǎo)致養(yǎng)殖鱖魚大批死亡.通過對(duì)病毒基因的測(cè)序結(jié)果的分析,基因組中的五個(gè)開放讀碼框(ORF)被推定編碼環(huán)指蛋白(RING finger protein):ORF12,ORF65,ORF66,ORF99,ORF111.在該實(shí)驗(yàn)中,五個(gè)ORF基因被克隆到質(zhì)粒pMAL-c2中,在體外表達(dá)融合蛋

2、白MBP-RING.經(jīng)過體外泛素化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明,ORF12,ORF65,ORF66,ORF111編碼具有泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)的功能的環(huán)指蛋白,該蛋白在泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme,E1)、泛素聚合酶(ubiquitin conjugating enzyme,E2)、鋅離子及ATP的協(xié)同下能發(fā)揮其功能.通過對(duì)ISKNV66蛋白的環(huán)指區(qū)域關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變,發(fā)

3、現(xiàn)ISKNV66蛋白的環(huán)指區(qū)域?qū)τ贓3酶的功能是至關(guān)重要的.為了觀察這些環(huán)指蛋白在細(xì)胞中的分布情況,這五個(gè)ORF基因與GFP基因被融合在一起,并構(gòu)建到pcDNA中,再把這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞.從熒光倒置顯微鏡中可以清楚地觀察到這些環(huán)指蛋白分布在細(xì)胞的不同位置,12-GFP分布在細(xì)胞質(zhì)中,66-GFP分布在非細(xì)胞核的細(xì)胞器上,111-GFP在轉(zhuǎn)染早期分布在細(xì)胞質(zhì)中,而后期逐漸集中成一個(gè)或幾個(gè)點(diǎn).這些蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并沒有