傳染性造血器官壞死病病毒的分離鑒定及其糖蛋白抗血清的制備和應用.pdf

1、本研究從吉林省某漁場患病的虹鱒幼魚中分離得到了一株病毒，毒株編號IHNV-1008，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及電鏡觀察的結果，確定該病毒分離株為傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)，并對其理化特性、生物特性進行了研究。同時，建立IHNV原核表達系統(tǒng)，表達出IHNV糖蛋白作為免疫原，免疫小鼠制備抗血清，并對其進行效價測定及與全病毒免疫反應等應

2、用。結果如下:
　　 本次所分離的病毒株，通過RT-PCR可擴增出特異性條帶，進一步對感染該病毒的細胞切片進行電鏡觀察，在細胞質中可見到大量病毒顆粒，呈典型彈狀，直徑約為(70～90) nm，長度(150～170) nm。挑斑純化后，對其特性進行研究，結果顯示該病毒能夠使EPC、FHM等5種常見水生細胞產(chǎn)生明顯細胞病變(Cytopathiceffects，CPE)，表現(xiàn)為細胞變圓，聚集成葡萄狀，形成空斑，最終完全脫離。病毒生長曲

3、線顯示產(chǎn)生CPE5 d后，病毒達到最大感染滴度，約為106.6TCID50/100μL。理化特性試驗結果顯示該病毒增殖溫度為10℃～25℃，最適溫度為15℃，不耐熱，對脂溶劑和酸敏感，對堿具有較強抗受能力。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示，該病毒蛋白條帶與IHNV文獻記載的相近似。
　　 以IHNV感染的細胞懸液為材料，應用RT-PCR方法克隆病毒的糖蛋白基因，并將其亞克隆至原核表達載體pCWori，轉化到大腸桿菌DH

4、5α，通過發(fā)酵大腸桿菌制備病毒糖蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析，誘導表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在，使用Ni-NTA親和層析柱在變性條件下進行純化并透析復性，最終得到了較高純度的可溶性糖蛋白，分子量約為57 KDa。免疫印跡(Western-blot)分析結果顯示所表達的蛋白能夠被兔抗IHNV血清識別。用復性后的蛋白免疫小鼠制備抗血清，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)顯示抗體效價可達1∶64000。經(jīng)制備的抗血清可以作為一抗建立ELI