傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）ORF24和ORF50囊膜蛋白鑒定及基因工程候選疫苗的研制.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)屬于虹彩病毒科，腫大細(xì)胞病毒屬。是可以導(dǎo)致鱖魚(yú)、美國(guó)紅魚(yú)等名貴水產(chǎn)魚(yú)類大批死亡的重要病源之一，近年來(lái)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了研制其基因工程疫苗，控制該病毒的流行，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，在ISKNV基因組中篩選了2個(gè)可能編碼囊膜蛋白的開(kāi)放讀碼框(OpenReadingFrame，ORF)ORF24和ORF50。 根據(jù)G

2、enBank上ORF24和ORF50的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增了兩個(gè)基因。將這兩個(gè)基因連接到原核表達(dá)載體pET32a(novagen)，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-24和pET32a-50，再將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白VP24分子量約為50.6KD，VP50約為31.1kD，經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定，證實(shí)了BL21正確表達(dá)了目的蛋白。表

3、達(dá)的融合蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在，提取的包涵體中融合蛋白含量占50％以上，經(jīng)柱層析純化蛋白，純化度達(dá)90％以上。 以SDS-PAGE純化的兩種融合蛋白作抗原，分別免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。ELISA檢測(cè)兩種抗血清效價(jià)達(dá)1:11000。Western-blot檢驗(yàn)，兩種抗血清中的IgG都能與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。 從病魚(yú)組織中提取ISKNV病毒粒子。利用葡萄球菌pansorbine能吸附抗血清中的IgG，輔助抗

4、原抗體特異性結(jié)合的特性，檢測(cè)兩種多克隆抗體是否能與病毒囊膜特異性結(jié)合，從而證明相應(yīng)基因的功能。結(jié)果ORF50編碼囊膜蛋白。 將重組菌BL21/pET32a-24和pET32a-50表達(dá)的融合蛋白制備成疫苗，給鱖魚(yú)注射進(jìn)行主動(dòng)免疫。陰性對(duì)照組注射PBS不攻毒，陽(yáng)性對(duì)照組不免疫(以下同)。兩種蛋白的為混合疫苗免疫鱖魚(yú)效果最好，最后疫苗組相對(duì)存活率(relativepercentagesurvival，RPS)有75％。同時(shí)，陰性對(duì)照

5、組無(wú)死亡，而陽(yáng)性對(duì)照組全部死亡(以下同)。 被動(dòng)免疫，先注射多克隆抗血清24小時(shí)后再注射病毒液，RPS60％；先注射病毒液24小時(shí)后再多克隆抗血清，RPS20％。中和實(shí)驗(yàn)，將兩種兔抗融合蛋白血清與病毒液1:1:1比例混合，常溫孵育10-15分鐘后，注射鱖魚(yú)，RPS為80％。 對(duì)廣東南海2000尾池養(yǎng)鱖魚(yú)進(jìn)行ISKNV基因工程疫苗中試，免疫方法和主動(dòng)免疫相同。隨即抽取20尾攻毒，RPS有70％。免疫實(shí)驗(yàn)表明所制備的疫苗對(duì)I