傳染性脾腎壞死病毒vSOCS基因功能及基因工程候選疫苗的研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是細(xì)胞腫大虹彩病毒屬的代表種，是引起我國養(yǎng)殖鱖魚大量死亡的傳染性疾病的病原體。利用生物信息學(xué)對(duì)ISKNV全基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ORF103R含有一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，推測編碼胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)。由于該蛋白僅存在于細(xì)胞腫大虹彩病毒屬中，故將其命名為病毒性細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(vSOCS)，并推薦該基因?yàn)榧?xì)胞腫大病毒的標(biāo)志基因之

2、一。vSOCS具有SOCS1的典型結(jié)構(gòu)域，但C—端缺失SOCS box結(jié)構(gòu)域。這是首次報(bào)道病毒基因組編碼SOCS家族類似蛋白—vSOCS，也是繼哺乳動(dòng)物CIS，SOCS1～7，魚類SOCS8，SOCS9后發(fā)現(xiàn)的第十一個(gè)SOCS蛋白家族新成員。通過鄰接法(Neighbor—Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)vSOCS與魚類SOCS1基因在進(jìn)化上相距最近，并且與脊椎動(dòng)物SOCS1蛋白構(gòu)成一個(gè)大的蛋白亞家族。因此，推測vSOC

3、S在進(jìn)化上可能與魚類SOCS1基因來源于一個(gè)共同的祖先基因。 利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，證實(shí)了vSOCS具有完全封閉IFN—α/γ誘導(dǎo)的ISRE/GAS—啟動(dòng)子的活化，該抑制效果與vSOCS表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量存在劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步通過免疫共沉淀方法分析，發(fā)現(xiàn)vSOCS在細(xì)胞內(nèi)的靶向信號(hào)分子為JAK(janus kinase)蛋白激酶，體外實(shí)驗(yàn)表明vSOCS能抑制其激酶活性。在此基礎(chǔ)上，通過Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)vSO

4、CS削弱了干擾素誘導(dǎo)的STAT1(signal transducer and activator of transcription1)和STAT3蛋白的磷酸化水平。TransAMTM STAT轉(zhuǎn)錄因子活性分析和凝膠阻滯(electrophoretic mobility shiftassay，EMSA)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了vSOCS能抑制STAT轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，從而揭示vSOCS具有抑制干擾素誘導(dǎo)的JAK—STAT信號(hào)通路的生物學(xué)功能。為

5、探討vSOCS的活性功能位點(diǎn)，11個(gè)vSOCS單核苷酸突變體被構(gòu)建。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與哺乳動(dòng)物SOCS1的F59D和R105K突變體相似，vSOCS的F18D和R64K突變體能明顯降低其對(duì)JAK—STAT信號(hào)通路的抑制作用。并且兩個(gè)未報(bào)道的突變體(S66A和S85A)亦能明顯降低對(duì)IFN—α/γ誘導(dǎo)的ISRE/GAS—啟動(dòng)子活性的抑制效果。間接免疫熒光法分析則首次揭示在HepG2細(xì)胞內(nèi)vSOCS與窖蛋白(caveolin-1)共

6、定位。對(duì)氯化銫梯度密度離心分離的細(xì)胞器進(jìn)行western blot分析，發(fā)現(xiàn)vSOCS存在于含有胞膜窖(caveolae)細(xì)胞器的組分中。由于caveolae細(xì)胞器上富集了大量信號(hào)分子，因此推測vSOCS對(duì)JAK—STAT信號(hào)通路的影響可能是vSOCS與多種細(xì)胞因子信號(hào)通路相互作用的結(jié)果。 為進(jìn)一步研究vSOCS基因在ISKNV感染中的地位和作用，我們利用自制的vSOCS兔源多克隆抗體(anti—MBP—vSOCS)對(duì)ISKVN

7、進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，結(jié)果顯示vSOCS是ISKNV的組成蛋白之一。進(jìn)一步，利用基因工程原理成功地構(gòu)建了缺失vSOCS基因的重組ISKNV病毒(△m—vSOCS)以分析vSOCS對(duì)整個(gè)病毒粒子感染活性的貢獻(xiàn)，這也是首次在細(xì)胞腫大病毒中成功建立重組缺失病毒。首先利用poly(I：C)刺激鱖仔魚細(xì)胞(MFF-1 cell)，通過實(shí)時(shí)定量PCR(real—time quatitative PCR)方法檢測IFN下游激活基因的表達(dá)變化，建立了以Mx

8、、IRF-1和SOCS1基因?yàn)榘谢虻镊ZJAK—STAT檢測指標(biāo)。在上述研究基礎(chǔ)上，分別用ISKNV和△m—ySOCS病毒感染MFF-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染△m—vSOCS病毒株的MFF-1細(xì)胞，其JAK—STAT信號(hào)通路的活化程度明顯高于ISKNV感染細(xì)胞，這一結(jié)果反向論證了vSOCS在鱖魚中具有抑制JAK—STAT信號(hào)通路的功能。通過鱖魚活體感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ISKNV感染鱖魚的死亡率為100％，而相同感染滴度的△m—vSOCS病毒株感染鱖魚