白細(xì)胞介素-37(IL-37)在人體外周血CD4+效應(yīng)T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及對其免疫功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.探求白細(xì)胞介素-37(interleukin-37，IL-37)在人外周血CD4+效應(yīng)T細(xì)胞（effectorTcells）中的表達(dá)情況。
　　2.研究在脂多糖(LPS)刺激下，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞活化程度與IL-37表達(dá)水平的時(shí)效關(guān)系。
　　3.證明IL-37可以抑制CD4+效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。
　　方法:
　　第一部分:分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用免疫磁珠分選分選C

2、D4+T淋巴細(xì)胞，通過胎盤藍(lán)檢測細(xì)胞活性，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD4+效應(yīng)T細(xì)胞純度。
　　1.增殖活性檢測:設(shè)置刺激劑組（脂多糖-LPS:1ug/ml）、陰性對照組（即無LPS刺激細(xì)胞組），通過CCK-8技術(shù)檢測不同分組之間CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活性差異，得出刺激時(shí)間(24h、48h、72h)與細(xì)胞增殖活性時(shí)效關(guān)系。2.IL-37基因水平表達(dá)情況:通過PCR技術(shù)明確CD4+效應(yīng)T細(xì)胞中IL-37mRNA的表達(dá)。
　　3.I

3、L-37蛋白水平表達(dá)情況:分別通過Western blot技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測LPS刺激下，不同刺激時(shí)間下(24h、48h、72h)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞中IL-37蛋白表達(dá)水平差異。
　　4.IL-37細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位:通過免疫熒光與激光掃描共聚焦技術(shù)檢測IL-37蛋白在效應(yīng)T淋巴細(xì)胞中表達(dá)情況，明確其表達(dá)位置。
　　第二部分:分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，應(yīng)用免疫磁珠分選技術(shù)獲得CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，應(yīng)用小分子干擾R

4、NA沉默效應(yīng)T細(xì)胞中IL-37的表達(dá)，另設(shè)置siRNA-scramble無效干擾細(xì)胞組、正常對照細(xì)胞組。
　　1.siRNA-IL-37蛋白水平抑制效果檢測:采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測小分子干擾RNA對IL-37的沉默效果，對比siRNA-scramble干擾后效應(yīng)T細(xì)胞組、正常對照效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在LPS刺激作用72h后，IL-37表達(dá)情況。
　　2.增殖活性檢測:采用CCK-8法檢測siRNA-scramble干擾后細(xì)胞組、正常

5、細(xì)胞組、siRNA-IL37干擾后細(xì)胞組在LPS刺激72h時(shí)的增殖活性。
　　3.通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測siRNA-scramble干擾組、正常細(xì)胞組、siRNA-IL-37干擾組細(xì)胞中CD152表達(dá)情況。
　　4.細(xì)胞效應(yīng)因子檢測:采用Elisa技術(shù)，檢測正常對照細(xì)胞組、siRNA-IL37干擾后T細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-17水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.健康志愿者

6、外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)經(jīng)過磁珠分選，應(yīng)用胎盤藍(lán)試劑染色檢測，細(xì)胞活性大于98％;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測得到CD4+效應(yīng)T淋巴純度達(dá)99％。
　　2.應(yīng)用LPS刺激效應(yīng)T淋巴細(xì)胞激活，采用CCK-8法檢測不同時(shí)間段(24h、48h、72h)效應(yīng)T細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示其在刺激達(dá)到72h時(shí)增殖活性最高。
　　3.通過PCR技術(shù)檢測，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞中存在IL-37-mRNA的表達(dá)，且隨著LPS刺激作用時(shí)間的延長，IL-37

7、-mRNA表達(dá)水平逐漸升高。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞可表達(dá)IL-37蛋白;隨著LPS刺激作用時(shí)間的延長(24h、48h、72h)，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞中IL-37蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P＜0.05)。
　　5.通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞表達(dá)IL-37蛋白，且隨著LPS刺激時(shí)間的延長(24h、48h、72h)，細(xì)胞中IL-37-FITC表達(dá)水平增高。
　　6.免疫熒光與激

8、光掃描共聚焦結(jié)果顯示，CD4+效應(yīng)T淋巴細(xì)胞中表達(dá)IL-37，可在細(xì)胞核、胞質(zhì)表達(dá)，以細(xì)胞核周圍表達(dá)最為豐富。
　　7.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞中CD152表達(dá)水平顯示，siRNA-IL-37干擾組效應(yīng)T細(xì)胞CD152表達(dá)水平較siRNA-scramble干擾組及正常細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　8.CCK-8檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，相比于siRNA-scramble干擾組及正常對照細(xì)胞

9、組，siRNA-IL-37細(xì)胞組在450nm波長處OD值明顯升高(P＜0.05)，表明該組效應(yīng)T細(xì)胞增殖活性升高;siRNA-scramble干擾組與正常效應(yīng)T細(xì)胞相比較，OD450值無明顯差異性(P＞0.05)，表明siRNA-scramble干擾組對效應(yīng)T淋巴細(xì)胞抑制效應(yīng)微弱，與正常組無明顯差異。
　　9.采用Elisa技術(shù)，檢測siRNA-IL-37沉默后效應(yīng)T淋巴細(xì)胞組及正常對照組細(xì)胞在LPS刺激作用培養(yǎng)下72h后，細(xì)胞培

10、養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ含量，結(jié)果表明siRNA-IL-37干擾后，四種細(xì)胞因子含量均有不同程度的升高，于正常組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明IL-37的表達(dá)可能影響CD4效應(yīng)T淋巴細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的生成。
　　10.比較siRNA-IL-37干擾組及正常細(xì)胞組細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ/IL-4值，相對于正常對照組細(xì)胞，siRNA-IL-37干擾后細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ/IL-4比

11、值升高，但無顯著差異(P＞0.05)，本次實(shí)驗(yàn)尚不能明確IL-37對效應(yīng)T細(xì)胞中Th1、Th2細(xì)胞極化趨勢的作用。
　　結(jié)論:
　　1.健康人體外周血CD4+效應(yīng)T淋巴能夠表達(dá)IL-37。
　　2.在炎癥環(huán)境刺激下，隨著IL-37的表達(dá)水平隨著效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化水平增高而升高，本實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，IL-37在細(xì)胞活性最強(qiáng)的72小時(shí)表達(dá)尤為明顯，并且IL-37蛋白表達(dá)水平與信使RNA時(shí)效性趨勢相同。
　　3.IL-37在