Lefty基因在子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程中的作用研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜在卵巢排卵后及妊娠期間為準(zhǔn)備及維持妊娠而發(fā)生的一系列重塑反應(yīng)稱(chēng)為蛻膜化(Decidualization)，狹義的蛻膜化定義是內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在雌、孕激素作用下發(fā)生的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)方面的變化。蛻膜化過(guò)程伴隨著內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)的一系列適應(yīng)性改變。蛻膜功能的正常表達(dá)在胚胎著床、妊娠的建立與維持，以及分娩發(fā)動(dòng)均起著重要的作用，研究其生長(zhǎng)、退化和調(diào)控，對(duì)于明確胚胎著床機(jī)制和生育調(diào)節(jié)具有重要的意義。

2、r>　　復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是產(chǎn)科領(lǐng)域常見(jiàn)問(wèn)題，一直困擾著廣大醫(yī)生和患者，其病因復(fù)雜。近幾年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化能力降低，導(dǎo)致胚胎著床“窗口期”延長(zhǎng)、損傷胚胎或者對(duì)異常胚胎識(shí)別能力減低而發(fā)病，但是蛻膜化降低的原因和機(jī)制目前尚不清楚。
　　Lefty基因是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員中為數(shù)不多的抑制劑之一，屬于細(xì)胞信號(hào)分子，Lefty基因及其下游smad通路參與胚胎干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等早發(fā)事件。Lefty基因在人類(lèi)

3、分泌晚期及月經(jīng)期的子宮內(nèi)膜中特異性表達(dá)，可以誘導(dǎo)增生期子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶3、7、9，參與周期性的內(nèi)膜基質(zhì)分解及脫落調(diào)節(jié)過(guò)程。但在胚胎著床期的子宮內(nèi)膜，Lefty基因卻無(wú)表達(dá);同樣的研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥或子宮腺肌癥所致不孕患者的內(nèi)膜中，Lefty蛋白的不成熟形式，即分子量為44kDa多肽大量表達(dá)。在小鼠的整個(gè)月經(jīng)周期及妊娠1-3天內(nèi)，Leftym RNA及蛋白均有表達(dá)，妊娠第9天消失;但Lefty基因轉(zhuǎn)染內(nèi)膜后，小鼠胚

4、胎著床率明顯減少。Lefty在子宮內(nèi)膜中這種特殊的表達(dá)方式，提示其與子宮內(nèi)膜蛻膜化有關(guān)。但是在人類(lèi)子宮蛻膜中，隨著妊娠的建立及維持，Lefty是否表達(dá)及變化趨勢(shì)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們擬通過(guò)PCR、Western blotting等生物化學(xué)方法，檢測(cè)Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)子宮蛻膜組織中的表達(dá)，證明Lefty在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)增加，參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜化受損過(guò)程。
　　子宮蛻膜化反應(yīng)最明顯的特征是內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、分

5、化成多倍體蛻膜細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為大的單核或雙核細(xì)胞，DNA增加4倍、8倍、或者更多倍，表明細(xì)胞經(jīng)過(guò)了核內(nèi)復(fù)制而不是細(xì)胞分裂。核內(nèi)復(fù)制的特點(diǎn)提示我們?cè)陂g質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中，細(xì)胞周期的改變導(dǎo)致DNA復(fù)制而無(wú)細(xì)胞分裂。在生殖周期中，子宮受到雌孕激素的調(diào)節(jié)，其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子也因發(fā)生周期性改變而發(fā)揮作用。在增殖期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，特殊的周期素及周期素依賴(lài)鏈激酶表達(dá)增加，而在分泌期，P57等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在孕激素作用下表達(dá)增加。關(guān)

6、于Lefty在蛻膜化過(guò)程中與細(xì)胞周期關(guān)系的研究極少。因此，我們擬通過(guò)基因重組、RNA干擾等分子生物學(xué)方法，檢測(cè)體外間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞周期因子cyclinD1及P57的表達(dá)，證明Lefty基因通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)抑制間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。
　　方法：
　　一、Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達(dá)
　　1、PCR方法檢測(cè)早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty mRNA的表達(dá)水平。
　

7、　2、免疫組織化學(xué)法、Western Blotting法檢測(cè)早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、正常早期妊娠的子宮蛻膜中Lefty蛋白表達(dá)。
　　二、Lefty基因在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hESC)蛻膜化過(guò)程中的表達(dá)及作用
　　1、原代培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hESC)并進(jìn)行傳代。
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定hESC細(xì)胞。
　　3、hESC體外蛻膜化誘導(dǎo)及蛻膜化標(biāo)志物PRL、IGFBP-1檢測(cè)。
　　4、構(gòu)建pc-DNA3.1(

8、+)Lefty過(guò)表達(dá)載體，酶切鑒定及測(cè)序，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)48h的hESC。
　　5、靶向hESC中Lefty基因的SiRNA干擾及篩選，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)48h的hESC。
　　6、熒光定量PCR、Western Blotting檢測(cè)Lefty mRNA及蛋白表達(dá)，驗(yàn)證pcDNA3.1(+)-Lefty、SiRNA轉(zhuǎn)染效率。
　　7、Western Blotting檢測(cè)各組hESCs中P57、cyclinD1表達(dá)水平。

9、　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組hESCs上清液中PRL、IGFBP-1的含量。
　　9、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Lefty基因?qū)?xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：
　　一、Lefty在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常早期妊娠子宮蛻膜中的表達(dá)
　　1、PCR結(jié)果表明:妊娠早期子宮蛻膜Lefty mRNA相對(duì)表達(dá)水平為0.64±0.07，明顯低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組子宮蛻膜1.04±0.12(P＜0.05)。
　　2、免疫組織化學(xué)

10、結(jié)果表明:Lefty在子宮蛻膜組織的間質(zhì)細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，在妊娠早期子宮蛻膜陽(yáng)性表達(dá)率為20.0％，明顯低于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組85％(P＜0.05)。
　　3、Western blotting結(jié)果表明:在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常早期妊娠子宮蛻膜內(nèi)，Lefty蛋白均以裂解后的分子量為34kDa活性蛋白形式出現(xiàn)。
　　二、Lefty基因在人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hESC)蛻膜化中的作用
　　1、體外成功分離和培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hESC

11、)。
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果表明細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性，CD10染色陽(yáng)性，角蛋白、Ⅷ因子及白細(xì)胞共同抗原染色均陰性，證實(shí)為人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。
　　3、在MPA和8-Br-cAMP誘導(dǎo)下，hESC逐漸增大、變圓，胞漿透亮，細(xì)胞核增大。ELISA結(jié)果表明，培養(yǎng)上清液中的PRL和IGFBP-1在誘導(dǎo)第4天明顯增加，證實(shí)體外間質(zhì)細(xì)胞蛻膜化誘導(dǎo)成功。
　　4、構(gòu)建pcDNA3.1(+)-Lefty過(guò)表達(dá)載體，序列鑒定證

12、實(shí)。篩選SiRNA片段，其中Lefty-homo-872使用量50nM沉默效率最高，為86.63％。
　　5、熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果表明:hESC轉(zhuǎn)染Lefty過(guò)表達(dá)載體后，Lefty mRNA及蛋白明顯增加;hESC轉(zhuǎn)染SiRNA后，Lefty mRNA及蛋白明顯降低。hESC蛻膜化誘導(dǎo)后，Lefty未成熟蛋白減少，成熟蛋白增加。
　　6、ELISA結(jié)果表明:hESCs轉(zhuǎn)染Lefty過(guò)表達(dá)載體

13、后誘導(dǎo)，PRL、IGFBP-1分泌量明顯降低;hESCs轉(zhuǎn)染Lefty siRNA后誘導(dǎo)，PRL、IGFBP-1分泌量明顯增加。
　　7、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明:hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后，S期細(xì)胞比例明顯減少，G0/1期細(xì)胞比例明顯增加，發(fā)生G0/1至S期阻滯。hESCs轉(zhuǎn)染Lefty過(guò)表達(dá)載體后，能夠明顯逆轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)生的G0/1至S期阻滯。
　　8、Western blotting結(jié)果表明:hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后，P57蛋白增

14、加，Cyclin D1蛋白下降;轉(zhuǎn)染Lefty過(guò)表達(dá)載體后誘導(dǎo)，P57、Cyclin D1蛋白無(wú)明顯變化，轉(zhuǎn)染Lefty SiRNA后誘導(dǎo)，P57蛋白明顯上調(diào)，CyclinD1蛋白明顯下降。
　　結(jié)論：
　　1、Lefty基因及蛋白在早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織內(nèi)表達(dá)增加，可能通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜蛻膜化反應(yīng)，參與早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病過(guò)程。
　　2、Lefty基因通過(guò)調(diào)控cyclinD1及P57的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞周期、從而抑制