TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌病程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平
　　目的：探討子宮內(nèi)膜癌中TESTIN基因的表達(dá)水平，為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷提供依據(jù)。
　　方法：收集68例子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌組織68例及相應(yīng)的癌旁組織68例，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌60例，子宮漿液性乳頭狀腺癌8例。免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織及其癌旁正常組織中TESTIN基因的蛋白表達(dá)水平并對(duì)TESTIN基因表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用甲基化特異性PC

2、R檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織、細(xì)胞中TESTIN基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，分析其與TESTIN表達(dá)水平之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：子宮內(nèi)膜癌的癌旁正常組織中 TESTIN蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，而絕大部分(52／68)的子宮內(nèi)膜癌組織中TESTIN蛋白表達(dá)顯著下降（p<0.O1)。進(jìn)一步分析顯示：子宮內(nèi)膜樣腺癌組中TESTIN蛋白表達(dá)水平下降率較漿液性乳頭狀腺癌組明顯升高(χ2=13.34，p=0.001)。根據(jù)MSP的結(jié)果，44.1％(30/68)

3、的子宮內(nèi)膜癌中 TESNTIN啟動(dòng)子為高甲基化狀態(tài)，而在正常內(nèi)膜組織中僅為3.6%(1/28)，p<0.001)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示TESNTIN啟動(dòng)子高甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.03)顯著相關(guān)。同時(shí)，TESTIN表達(dá)水平下降與其高甲基化狀態(tài)相關(guān)(p=0.021)。甲基化處理可恢復(fù)AN3CA細(xì)胞內(nèi)TESTIN表達(dá)。
　　結(jié)論：TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)顯著下降，啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化是TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)缺失的主

4、要原因。
　　第二部分 TESTIN在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制
　　目的：探討TESTIN甲基化在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：分別構(gòu)建TESTIN過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TESTIN和干擾質(zhì)粒shRNA-TESTIN；將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞并構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR方法和western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TESTIN基因的表達(dá)。應(yīng)用MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell

5、實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)PCR和western blot等方法檢測(cè)TESTIN對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成和侵襲能力的影響，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，實(shí)時(shí)PCR和western blot方法檢測(cè)與EMT相關(guān)的E-鈣粘連蛋白、Snail，波蛋白和N-鈣粘連蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。分別使用TESTIN穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株建立建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型，觀察 TESTIN對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，驗(yàn)證TESTIN對(duì)E

6、MT過(guò)程的調(diào)控。
　　結(jié)果：在AN3CA細(xì)胞中，TESTIN過(guò)表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成和侵襲能力；同時(shí)，TESTIN過(guò)表達(dá)后誘導(dǎo)AN3CA細(xì)胞出現(xiàn)上皮性轉(zhuǎn)變，上皮性標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)水平明顯上升，而間質(zhì)性標(biāo)志物 Snail，N-cadherin，vimentin的表達(dá)則被顯著抑制；相反地，在TESTIN敲低的Ishikawa細(xì)胞中，細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成和侵襲能力得到增強(qiáng)；同時(shí)，干擾TESTIN基因后 Ish