meprin-α介導(dǎo)血管活性氧生成促進動脈粥樣硬化形成的作用及機制研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟水平提高和人口老齡化形勢的加重,動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康并導(dǎo)致死亡的最主要的疾病之一。動脈粥樣硬化是通過脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞增殖和鈣化以及炎癥細(xì)胞浸潤進而引起的一種以反應(yīng)性損傷-修復(fù)為特征的動脈血管疾病。動脈血管硬化和血管內(nèi)粥樣斑塊形成是AS的主要病理改變,可逐漸導(dǎo)致動脈管腔狹窄,造成心臟、腦及遠(yuǎn)端肢體缺血。近年來,對AS形成的機制研究的不斷深入,氧化應(yīng)激

2、反應(yīng)在AS形成中的作用受到越來越多的重視,但抗氧化藥物在防治AS進展方面并沒有取得預(yù)期的效果,氧化應(yīng)激與AS形成之間的關(guān)系值得進一步深入探討。
　　金屬蛋白酶meprin是哺乳動物細(xì)胞表面的一種含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白水解酶(Met-Zincin),在包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞表面廣泛分布。meprin包含α、β兩種亞基,在體內(nèi)的通過活化或者滅活細(xì)胞因子發(fā)揮生理作用,研究發(fā)現(xiàn)meprin-α在體內(nèi)與腫瘤發(fā)生和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)

3、。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)meprin-α參與AS形成,用meprin抑制劑actinonin(AC)慢性干預(yù)高脂飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠可顯著抑制其動脈血管壁的AS形成及進展,同時伴隨粥樣斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)目的減少和血管壁原位的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)生成減少,提示meprin-α可能通過調(diào)控血管壁的氧化應(yīng)激反應(yīng)參與AS的進展。但由于meprin-α在ApoE-/-小鼠的小鼠血管壁的表達(dá)較低,未能進一步明

4、確其具體作用機制。
　　表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一種廣泛分別在多種動物組織細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白受體,主要通過配體作用被激活進而發(fā)揮生理功能,促進細(xì)胞內(nèi)ROS生成。研究發(fā)現(xiàn)Met-Zincin蛋白水解酶家族成員可以在體內(nèi)活化EGFR的三個主要配體,包括表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF),肝素結(jié)合的表皮生長因子(heparin-bindi

5、ngEGF-likegrowthfactor,HB-EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-ɑ(transforminggrowthfactoralpha,TGF-ɑ),被活化的EGFR配體由于細(xì)胞類型和作用底物的不同而不同。meprin-α屬于Met-Zincin蛋白水解酶家族,我們推測其可能通過活化巨噬細(xì)胞的EGFR的配體激活EGFR,進而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS生成,參與AS進展。
　　基于以上假設(shè),本實驗擬構(gòu)建含有meprin-α的慢病毒載體對

6、高脂飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠進行在體干預(yù),運用分子生物學(xué)的技術(shù)從動物及細(xì)胞兩方面觀察meprin-α對AS形成和巨噬細(xì)胞ROS生成的影響并探討其作用機制。通過本研究可初步闡明meprin-α介導(dǎo)血管ROS生成促進動脈粥樣硬化形成的作用及機制,以及EGFR在巨噬細(xì)胞ROS生成過程中的作用及下游信號通路。有助于從一個新的角度揭示氧化應(yīng)激反應(yīng)與AS形成的關(guān)系,為進一步研究調(diào)控AS形成中的氧化應(yīng)激反應(yīng)提供實驗基礎(chǔ),為研究新的藥物靶點提供理論支持

7、。
　　方法:
　　一、構(gòu)建meprin-α慢病毒載體
　　1.委托上海捷瑞生物工程有限公司合成MEP1A基因。
　　2.以合成的MEP1A基因為模板PCR擴增目的基因。表達(dá)載體酶切后進行膠回收載體片段。目的基因與載體片段同源重組后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子,陽性克隆送測序。測序無誤的克隆進行質(zhì)粒抽提。
　　3.使用293T細(xì)胞進行病毒顆粒的包裝并進行滴度測定。二、動物實驗
　

8、　1、實驗動物及分組:150只雄性ApoE-/-小鼠(C57/BL6基因背景),6周齡,體重18-20g,隨機平均分為6組,每組25只。對照組(CON組)一直用普通飼料;其余5組高脂飼料飼養(yǎng),根據(jù)不同的干預(yù)方式分為:高脂組(HF組):11周開始予無菌生理鹽水(0.5ml/天)腹腔注射,連續(xù)注射4周。高脂+L-meprin-α組(HF+LM組):第11周經(jīng)尾靜脈注射L-meprin-α(1.84x108TU),之后予無菌生理鹽水(0.5m

9、l/天)腹腔注射,連續(xù)注射4周。高脂+L-meprin-α+AC組(HF+LM+AC組):第11周經(jīng)尾靜脈注射L-meprin-α(1.84x108TU),之后予AC(5mg/kg/day)腹腔注射,連續(xù)注射4周。高脂+L-meprin-α+AG1478組(HF+LM+AG組):第11周經(jīng)尾靜脈注射L-meprin-α(1.84x108TU),之后予AG1478(20mg/kg/day)腹腔注射,連續(xù)注射4周。高脂+L-EGFP組(HF

10、+LGFP組):第11周經(jīng)尾靜脈注射L-EGFP(1.92x108TU),之后予無菌生理鹽水(0.5ml/天)腹腔注射,連續(xù)注射4周。該組分別有3只小鼠在尾靜脈注射L-EGFP后的第1周、4周被處死,以確認(rèn)病毒在粥樣斑塊內(nèi)轉(zhuǎn)染的效率。所有各組ApoE-/-小鼠于第14周處死。
　　2、組織病理學(xué)觀察斑塊大小和數(shù)量的檢測:ApoE-/-小鼠用過量的戊巴比妥鈉腹腔麻醉后處死,取小鼠胸主動脈固定、包埋,切成5um厚的小片。組織制片后,常

11、規(guī)采用蘇木素-伊紅(hematoxylinandeosin,HE)染色,鏡下觀察粥樣斑塊形成,油紅O染色,大體水平上確定粥樣斑塊的數(shù)量和大小。
　　3、血管內(nèi)膜原位ROS生成的檢測:小鼠胸主動脈血管切片脫蠟處理后用DHE處理,通過共聚焦顯微鏡下可檢測并獲得圖像。用IPP6.0圖像分析軟件分析結(jié)果。
　　4、蛋白印跡法檢測(WesternBlot,WB)檢測血管內(nèi)膜的meprin-α的表達(dá):提取-80℃冰凍保存的小鼠胸主動脈粥

12、樣斑塊的組織克,蛋白通過SDS-PAGE法提取出來并轉(zhuǎn)位到PVDF膜上,一抗封閉并且孵育過夜。辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體檢測到條帶并化學(xué)發(fā)光。
　　5、免疫組織化學(xué)的方法檢測血管內(nèi)膜EGFR的表達(dá):小鼠胸主動脈血管切片用一抗包埋并于4℃孵育過夜,然后孵育生物素化的第二抗體30min,加入DAB直觀在顯微鏡下觀察。
　　三、細(xì)胞實驗
　　1、DHE熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS:在不同因素預(yù)處理J774A.1細(xì)胞的情況下,檢

13、測細(xì)胞內(nèi)ROS生成的情況,明確影響細(xì)胞內(nèi)ROS生成的因素及其相互關(guān)系。
　　2、ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白濃度:在不同因素預(yù)處理J774A.1細(xì)胞的情況下,吸取J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)液,用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中HB-EGF蛋白濃度,明確影響J774A.1細(xì)胞釋放HB-EGF的因素。
　　3、WB法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平:不同因素預(yù)處理J774A.1細(xì)胞的情況下,檢測EGFR及其下游信號蛋白分子的表達(dá)水平,明確影響

14、信號蛋白分子表達(dá)的因素及其相互關(guān)系。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較(One-wayANOVA),以P<0.01為有顯著性差異。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件完成。
　　結(jié)果:
　　一、慢病毒載體構(gòu)建
　　成功構(gòu)建含有MEP1A基因的慢病毒載體和pSB1對照載體。一、動物實驗部分
　　1、組織病理學(xué)觀察的情況
　?、臜E染

15、色:CON組血管壁三層結(jié)構(gòu)較清晰,內(nèi)膜光滑完整,平滑肌細(xì)胞排列整齊,動脈血管壁稍隆起形成非常少量的粥樣斑塊。內(nèi)皮下可見少量脂質(zhì)及炎性細(xì)胞浸潤,中層及外膜結(jié)構(gòu)清楚,未見病理改變;高脂飼料飼養(yǎng)的HF組可見血管壁彌漫性隆起,突向管腔面形成明顯斑塊,內(nèi)膜明顯增厚,內(nèi)膜結(jié)構(gòu)明顯破壞。內(nèi)膜下大量排列不規(guī)則平滑肌細(xì)胞增生,內(nèi)有脂質(zhì)沉積,形成大小不等、形態(tài)不規(guī)則的泡沫細(xì)胞,大量巨噬細(xì)胞浸潤,中層結(jié)構(gòu)紊亂,平滑肌增生、壞死,并有炎性細(xì)胞浸潤。彈力板處及細(xì)

16、胞間隙可見大量脂質(zhì)沉積。HF+LM組與HF組相比,血管內(nèi)膜形成的斑塊面積更大,內(nèi)膜增厚更明顯,脂質(zhì)沉積更多,斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤更加明顯;HF+LM+AG組和HF+LM+AC組與HF組相比,血管內(nèi)膜形成的斑塊面積減小,內(nèi)膜增厚,脂質(zhì)沉積減少,斑塊內(nèi)可見少量的巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞;HF+LGFP組與HF組相比,血管壁的變化基本接近。⑵油紅O染色:CON組胸主動脈柔軟富于彈性,內(nèi)膜光滑平整,僅有局部染色較深的損傷區(qū)域;高脂飼料飼養(yǎng)的HF組血管內(nèi)

17、膜可見片狀顏色較深的損傷區(qū)域,內(nèi)膜欠完整,大量內(nèi)膜結(jié)構(gòu)被破壞(P<0.01)。HF+LM組與HF組相比,損傷部位數(shù)量和面積均顯著增加(P<0.01);HF+LM+AG組和HF+LM+AC組與HF+LM組相比,損傷部位數(shù)量和面積均顯著減少(P<0.01)相比;HF+LGFP組與HF組相比,損傷部位數(shù)量和面積無明顯差異。
　　2、各組ApoE-/-小鼠血管內(nèi)膜原位ROS生成的情況
　　CON組胸主動脈血管內(nèi)膜原位僅有非常少量的R

18、OS生成,與CON組比較,HF組原位ROS生成增加(P<0.01)。與HF組相比,HF+LM組血管內(nèi)膜原位ROS生成顯著增加(P<0.01);與HF+LM組比較,HF+LM+AC組血管內(nèi)膜原位ROS生成顯著減少(P<0.01)。
　　3、各組ApoE-/-小鼠血管壁meprin-α表達(dá)的情況
　　CON組僅有少量meprin-α表達(dá),HF組血管內(nèi)膜meprin-α表達(dá)顯著增高(P<0.01)。4、各組ApoE-/-小鼠血管內(nèi)

19、膜EGFR表達(dá)的情況
　　CON組血管內(nèi)膜幾乎無EGFR表達(dá),HF組血管內(nèi)膜可見EGFR表達(dá),與HF組比較,HF+LM組EGFR表達(dá)顯著增加(P<0.01),而HF+LM+AC組幾乎沒有EGFR的表達(dá)。
　　二、細(xì)胞實驗部分
　　1、不同干預(yù)因素處理的情況下J774A.1細(xì)胞內(nèi)ROS生成的情況
　?、旁诟鹘M的比較中,與control組比較,OxLDL處理的細(xì)胞內(nèi)ROS生成均顯著增多。⑵與OxLDL處理的各組細(xì)胞比

20、較:OxLDL+AC、OxLDL+meprin-αsiRNA、OxLDL+AG1478、OxLDL+抗HB-EGF和p38抑制劑SB203580處理的細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯減少(P<0.01),OxLDL+meprin-α處理的細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多(P<0.01)。⑶與OxLDL+meprin-α處理的細(xì)胞比較,OxLDL+meprin-α+AG1478處理的細(xì)胞內(nèi)ROS明顯減少(P<0.01)。
　　2、不同干預(yù)因素處理的情況下J

21、774A.1細(xì)胞釋放HB-EGF的情況:
　?、排ccontrol組比較,OxLDL和OxLDL+meprin-α處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中HB-EGF濃度增加(P<0.01)。⑵與OxLDL處理的細(xì)胞比較,OxLDL+AC和OxLDL+meprin-αsiRNA處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中HB-EGF濃度減少(P<0.01)。
　　3、不同干預(yù)因素處理的情況下J774A.1細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的情況
　　⑴與control組比較,OxLDL處

22、理的細(xì)胞EGFR、p38和PI3K-Akt磷酸化水平增多,GTP-rac1表達(dá)增高(P<0.01);⑵與OxLDL處理的細(xì)胞比較,抗HB-EGF抗體、AC或者meprin-αsiRNA處理的細(xì)胞EGFR磷酸化水平減少(P<0.01),AC、meprin-αsiRNA、Rac1抑制劑EHT1864和PI3K抑制劑wortmsnin處理的細(xì)胞內(nèi)p38磷酸化水平降低(P<0.01),wortmsnin處理的細(xì)胞內(nèi)GTP-rac1表達(dá)水平顯著降

23、低(P<0.01),AC和meprin-αsiRNA,以及AG1486處理的細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt磷酸化水平顯著降低(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、meprin-α通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激促進高脂飼養(yǎng)的Ape-/-小鼠胸主動脈粥樣斑塊形成，meprin-α抑制劑AC和EGFR抑制劑AG均可抵消meprin-α的作用。meprin-α是EGFR的上游信號分子，通過影響EGFR的表達(dá)和活性發(fā)揮作用。
　　2、meprin-