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文檔簡介
1、第一章、毒死蜱對高脂飲食致免AS形成的影響及相關機制研究
目的:
探討毒死蜱對高脂飲食致動脈粥樣硬化形成的影響及相關機制。
方法:
1.32只健康雄性新西蘭兔隨機分為如下四組(n=8):對照組、毒死蜱組、高脂飲食組、高脂飲食+毒死蜱組。高脂飲食配方為通用配方,毒死蜱的劑量為(20 mg/kg/d,毒死蜱兔的口服LD50為1000-2000 mg/kg),連續(xù)觀察6個月。
2、 2.動物處死前從耳緣靜脈取血并分離出血清儲存,用于檢測血脂水平和膽堿酯酶(AChE)、對氧磷酶1(PON1)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)的含量,及相關肝、腎功能指標。
3.收集并培養(yǎng)腹腔巨噬細胞,測定其膽固醇流出率。
4.切取一段胸主動脈采用離體血管環(huán)灌流法檢測血管舒縮功能。
5.采用蘇丹Ⅳ染色法觀察胸主動脈粥樣硬化斑塊,計算斑塊與血管內(nèi)皮表面積的百分比。頸總動脈、主
3、動脈弓作石蠟切片,用以觀察血管的形態(tài)學變化。
6.采用實時定量PCR和蛋白印跡法分別檢測肝、血管組織和腹腔巨噬細胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)的表達以及肝臟PON1的表達。
結(jié)果:
1.高脂飲食6個月,其血漿總膽固醇和脂蛋白水平明顯升高,SOD活性降低,而MDA水平升高,其肝臟、主動脈和腹腔巨噬細胞中ABCA1的表達升高,腹腔巨噬細胞中膽固醇流出增加,肝臟中PON1的表達降低,與對
4、照組相比,均有顯著性差異;其主動脈和頸總動脈有明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成。但血清AChE有輕度升高,但無顯著性差異。
2.毒死蜱組兔血清AChE和PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,與對照組比較有顯著性差異;肝腎功能指標與對照組比,無顯著性差異。主動脈和腹腔巨噬細胞ABCA1的表達、肝臟PON1的表達均有降低,腹腔巨噬細胞中膽固醇流出減少,與對照組比較有顯著性差異。
3.高脂飲食+毒死
5、蜱組PON1、和SOD活性和HDL-C水平降低,MDA水平升高,主動脈和腹腔巨噬細胞ABCA1的表達、肝臟PON1的表達均有降低,腹腔巨噬細胞中膽固醇流出減少,與單高脂飲食組或毒死蜱組相比,上述指標的改變更明顯,統(tǒng)計學處理有顯著性差異。主動脈和頸總動脈粥樣硬化斑塊更加明顯。但血清AChE無明顯改變。
結(jié)論:
亞毒性劑量的毒死蜱可加快高脂飲食致動脈粥樣硬化形成,加重血清中總膽固醇、脂蛋白、及其它生化指標的改變,
6、其機制可能與毒死蜱消耗有抗氧化作用的PON1和降低其活性,從而間接或直接觸發(fā)氧化應激,損傷內(nèi)皮功能,降低體內(nèi)ABCA1的表達,繼而減少膽固醇流出有關。
第二章、對氧磷促鼠源巨噬細胞性泡沫細胞形成及機制探討
目的:
探討對氧磷對Ox-LDL誘導的鼠源巨噬細胞性泡沫細胞形成及相關機制
方法:
1.將RAW264.7巨噬細胞,分為下例5組:(1)對照組,(2)Ox-LDL泡
7、沫細胞模型組,(3-5)組分別為Ox-LDL+對氧磷(1、10和100μmol/1)組。各組細胞置5%CO2培養(yǎng)箱,37℃,常規(guī)培養(yǎng)72 h。
2.油紅染色進行形態(tài)學觀察,高效液相色譜法測定細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)水平,及膽固醇流出率。
3.采用實時定量PCR和蛋白印跡法分別檢測巨噬細胞中CD36、ABCA1、和酰基輔酶A膽固醇?;D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)的表達。
結(jié)果:
8、 1.Ox-LDL處理48 h后,與正常巨噬細胞相比,油紅O染色陽性細胞顯著增加,細胞體積明顯增大,形態(tài)多呈圓形或不規(guī)則形;對氧磷(10,100μ mol/l)組細胞油紅O染色陽性細胞比Ox-LDL模型組形態(tài)學改變更明顯,細胞體積明顯增大,而對氧磷(1μ mol/l)組細胞與模型組相比沒有顯著性差異。
2.泡沫細胞模型組細胞內(nèi)TC、FC、CE水平顯著高于對照組,且CE/TC有顯著性差異;對氧磷(10,100μmol/
9、l)組細胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC均有顯著性增加,與泡沫細胞模型組相比,有顯著性差異,對氧磷(1μmol/l)組TC、FC、CE與泡沫細胞模型組差異無顯著性。
3.Ox-LDL泡沫細胞模型組細胞膽固醇流出率顯著性增加,與對照組相比,有顯著性差異;對氧磷(10和100μmol/l)組細胞膽固醇流出率顯著性降低,與泡沫細胞模型組相比,有顯著性差異;對氧磷(1μmol/l)處理組與泡沫細胞模型組相之間無顯著性差異。
10、r> 4.Ox-LDL刺激的泡沫細胞組與對照組比CD36 mRNA表達顯著增加,Ox-LDL刺激的泡沫細胞加對氧磷(10和100μmol/l)組與泡沫細胞組相比CD36 mRNA表達顯著增加。對氧磷(1μmol/l)處理組與泡沫細胞模型組相比沒有顯著性差異。
5.泡沫細胞模型組ABCA1表達較對照組顯著增加;與模型組相比,對氧磷(10和100μmol/1)顯著地下調(diào)了泡沫細胞中ABCA1的表達,而對氧磷(1μmol/
11、l)沒有影響泡沫細胞中ABCA1的表達。
6.泡沫細胞模型組ACAT1mRNA表達較對照組顯著增加;與模型組相比,對氧磷(10和100μmol/l)組顯著地增加了泡沫細胞中ACAT1的表達,而對氧磷(1μmol/l)處理組沒有明顯增加泡沫細胞的ACAT1mRNA表達。
結(jié)論:
對氧磷能加速Ox-LDL誘導的鼠源巨噬細胞性泡沫細胞形成。其機制可能與對氧磷上調(diào)泡沫細胞中CD36和ACAT1表達而降低
12、ABCA1的表達有關。
第三章、對氧磷通過干預cAMP信號通路下調(diào)鼠源巨噬細胞性泡沫細胞ABCA1表達和膽固醇流出
目的:
探討對氧磷下調(diào)鼠源巨噬細胞性泡沫細胞ABCA1表達和膽固醇流出的機制
方法:
1.將Ox-LDL刺激形成的鼠源巨噬細胞性泡沫細胞分為以下組:(1)對照組,(2)對氧磷處理組:對氧磷(1,10和100μmol/l)孵育泡沫細胞24 h;對氧磷(10
13、0μmol/1)孵育泡沫細胞(6,12,24)h。
2.高效液相色譜法測定測定細胞內(nèi)TC及FC水平,計算CE,測定膽固醇流出率。
3.采用ELISA法檢測泡沫細胞內(nèi)cAMP水平、腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二脂酶的活性。
4.采用實時定量PCR和蛋白印跡分別檢測泡沫細胞中ABCA1的mRNA和蛋白水平的表達。
結(jié)果:
1.對氧磷以時間和劑量依賴的方式增加RAW264.7巨噬細胞
14、源性泡沫細胞中TC、FC和CE水平,降低ABCA1表達和膽固醇流出。
2.對氧磷降低了細胞中cAMP的水平及腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性和增加磷酸二酯酶(PDE)的活性。
3.cAMP的類似物雙丁酰環(huán)腺苷酸(dBcAMP)能抑制對氧磷降低ABCA1表達和部分阻斷對氧磷降低膽固醇流出的作用。
4.AC激動劑福斯高林(Forskolin)和PDE抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)能拮抗對氧磷
15、降低cAMP的作用。
結(jié)論:
對氧磷下調(diào)鼠源巨噬細胞性泡沫細胞ABCA1的表達,降低細胞內(nèi)膽固醇流出和增加細胞內(nèi)膽固醇堆積可能與干預cAMP信號通路有關。
第四章、對氧磷酶1基因轉(zhuǎn)染對對氧磷促巨噬細胞源性泡沫細胞形成的影響
目的:
觀察外源性PON1基因轉(zhuǎn)染對對氧磷促鼠源巨噬細胞性泡沫細胞形成的影響
方法:
1.實驗分為以下各組:(1)PA
16、W巨噬細胞組、(2)Ox-LDL+RAW巨噬細胞組、(3)對氧磷+Ox-LDL+RAW巨噬細胞組、(4)對氧磷+Ox-LDL+PON1(+)RAW巨噬細胞組。將外源性的人的PON1基因轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,用Ox-LDL(50μg/ml)誘導泡沫細胞形成,對氧磷處理組加對氧磷(100μmol/1)共孵育48 h。
2.油紅染色進行形態(tài)學觀察,高效液相色譜法測定細胞內(nèi)TC及FC水平,計算CE水平,測定膽固醇流出率。
17、> 結(jié)果:
1.Ox-LDL+RAW細胞組細胞內(nèi)TC、FC、CE水平和CE/T值與RAW細胞組相比顯著性增高;對氧磷(100μmol/1)+Ox-LDL+RAW細胞組組細胞內(nèi)TC、FC、CE水平及CE/TC較Ox-LDL+RAW細胞組均有顯著性增加,而PON1轉(zhuǎn)染拮抗了對氧磷的作用。
2.Ox-LDL+RAW組細胞膽固醇流出率與RAW細胞相比顯著性增加;與Ox-LDL+RAW細胞組相比,對氧磷(100μ
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