降鈣素基因相關(guān)肽對成骨樣細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞交互作用的調(diào)控機制研究.pdf

1、骨折修復(fù)重建過程中，再生神經(jīng)和血管系統(tǒng)對骨痂發(fā)揮了嚴(yán)密的、實時的調(diào)控作用，相互協(xié)調(diào)，最終完成骨痂的結(jié)構(gòu)和功能重建。周圍神經(jīng)所分泌的神經(jīng)肽類物質(zhì)，降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related protein，CGRP)，在骨折修復(fù)過程中發(fā)揮了促進(jìn)骨痂生成的生物學(xué)作用。體外環(huán)境下CGRP能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并證明成骨細(xì)胞表面有CGRP受體的存在，大量下游細(xì)胞信號通路得到證實。但細(xì)胞實驗研究中，多數(shù)實驗僅圍繞CGRP對成

2、骨細(xì)胞(Osteoblasts，OB)或破骨細(xì)胞(Osteoclasts，OC)等單一成骨相關(guān)細(xì)胞展開，而對多細(xì)胞間的交互調(diào)控作用(Cross-talk)研究較少，因此未能全面完整地說明CGRP在體內(nèi)多細(xì)胞環(huán)境下的促成骨機制。
　　 成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cells，VECs)之間存在一種相互影響、相互調(diào)控的OB-VECs間cross-talk機制。在骨痂中VECs不僅僅構(gòu)建了微血管簇

3、為骨痂提供了營養(yǎng)支持，還作為一種具有成骨誘導(dǎo)功能細(xì)胞，參與了MSCs的募集和誘導(dǎo)分化。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間cross-talk主要發(fā)生在兩個層面，一是經(jīng)由細(xì)胞膜之間的蛋白完成細(xì)胞與細(xì)胞間的直接作用，二是通過自分泌和旁分泌的方式完成細(xì)胞間的間接作用。而在骨折愈合過程中，骨痂中的CGRP陽性纖維沿著血管生長，并且有大量的體外實驗證實，CGRP在血管再生和形成中也發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，說明CGRP參與了對OB-VECs之間Cross-talk的調(diào)

4、控。
　　 基于骨痂中的CGRP對成骨的調(diào)控機制可能與VECs細(xì)胞相關(guān)這一推測，本實驗依據(jù)課題組的前期預(yù)實驗結(jié)果，建立CGRP干預(yù)的OB-VECs共培養(yǎng)體系體，通過對VECs細(xì)胞旁分泌成骨因子的檢測，和OB細(xì)胞對應(yīng)因子受體表達(dá)及細(xì)胞分化指標(biāo)的檢測，探討CGRP對OB-VECs間cross-talk的調(diào)控機制。從而在體內(nèi)及體外多細(xì)胞環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)并證實神經(jīng)通過對VECs旁分泌的調(diào)控作用發(fā)揮了促成骨效應(yīng)，進(jìn)一步闡述骨痂中神經(jīng)對血管和成

5、骨交互調(diào)控的作用機制。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：美國ATCC公司人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs和人骨肉瘤細(xì)胞MG-63細(xì)胞株，加入含10％FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基，以5×106/瓶密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中，置于5％CO2孵箱中37℃孵育72或96h傳代，培養(yǎng)傳代，6.8代細(xì)胞用于共培養(yǎng)實驗。
　　 2、共培養(yǎng)體系建立：
　　 2.1直接共培養(yǎng)：MG-63和HUVECs細(xì)胞經(jīng)0.25％胰蛋

6、白酶消化后，用含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液配制成單個細(xì)胞懸液，按照不同混合比例的細(xì)胞懸液以1×105個/孔密度接種到12孔板，培養(yǎng)后24h后將細(xì)胞至于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。
　　 2.2間接共培養(yǎng)：將MG-63細(xì)胞以5×105濃度接種于12孔板，安裝0.4μm孔徑的12孔板Transtwell小室，將HUVECs細(xì)胞以5×105濃度接種于Transtwell小室內(nèi)。
　　 3.間接共培養(yǎng)環(huán)境下MG-63細(xì)胞的分化：

7、r>　　 3.1 MG-63細(xì)胞Collagen I mRNA檢測：間接培養(yǎng)24h，48h，72h和96h后，提取MG-63細(xì)胞mRNA用于實驗檢測。Real time PCR檢測共培養(yǎng)環(huán)境對MG-63細(xì)胞Collagen I mRNA表達(dá)改變影響；
　　 3.2培養(yǎng)液中OC檢測：間接培養(yǎng)24h，48h，72h和96h后，提取培養(yǎng)液于實驗檢測，ELISA檢測共培養(yǎng)環(huán)境對MG-63細(xì)胞OC表達(dá)改變影響。
　　 4.CGR

8、P對間接共培養(yǎng)環(huán)境下MG-63細(xì)胞分化的生物學(xué)作用：
　　 4.1 CGRP對間接共培養(yǎng)環(huán)境下MG-63細(xì)胞Collagen I mRNA表達(dá)的作用：
　　 以量效組100nM，10nM，1 nM和0.1 nM，和時效組0h，24h，48h，72h和96h分組，CGRP干預(yù)MG-63-HUVECs共培養(yǎng)體系，獲取MG-63細(xì)胞mRNA，Real timePCR檢測各組細(xì)胞Collagen I mRNA表達(dá)差異。
　

9、　 4.2 CGRP對間接共培養(yǎng)環(huán)境下MG-63細(xì)胞OC表達(dá)的作用：
　　 以量效組100nM，10nM，1 nM和0.1 nM，和時效組0h，24h，48h，72h和96h分組，CGRP干預(yù)MG-63-HUVECs共培養(yǎng)體系，獲取MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液，ELISA檢測各組細(xì)胞OC表達(dá)差異。
　　 5.共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的VEGF調(diào)控機制：
　　 5.1共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的VEGF-A分泌變化：<

10、br>　　 10nM的CGRP作用于MG-63、HUVECs和MG-63-HUVECs間接共培養(yǎng)體系，作用0h，12h，24h，36h，和48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液或細(xì)胞，進(jìn)行ELISA和Real Time-PCR測定。
　　 5.2共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞VEGF受體的表達(dá)變化：
　　 將MG-63與HUVECs細(xì)胞Transtwell小室內(nèi)間接共培養(yǎng)，未加Transtwell小室的MG-63培養(yǎng)為空白

11、對照組(CON)，單獨培養(yǎng)加入10nM CGRP的為CGRP作用組(CGRP)；加入Transwell及HUVECs的為共培養(yǎng)組(CO)，同時加入CGRP干預(yù)的為實驗組(EXP)。培養(yǎng)48h后對MG-63細(xì)胞的VEGFR1/2進(jìn)行免疫熒光檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1.MG-63-HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)：
　　 1.1直接共培養(yǎng)：MG-63和HUVECs細(xì)胞按照1:4，1:2，1:1，2:1和4:1比例進(jìn)行共培養(yǎng)

12、，24h發(fā)現(xiàn)MG-63：HUVECs按照比例為1:1的直接共培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞生長最為良好，細(xì)胞間雜生長，其中HUVECs細(xì)胞呈結(jié)節(jié)樣生長，MG-63細(xì)胞生長于內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)節(jié)周圍。DiI熒光標(biāo)記后，MG-63-HUVECs共培養(yǎng)體系24h，HUVECs細(xì)胞呈結(jié)節(jié)樣生長，MG-63細(xì)胞生長于內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)節(jié)周圍，48h，HUVECs細(xì)胞結(jié)節(jié)中央形成細(xì)胞壞死，72h，HUVECs細(xì)胞與MG-63細(xì)胞分層，MG-63細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)節(jié)內(nèi)浸潤生長，9

13、6h，HUVECs細(xì)胞出現(xiàn)類管型樣結(jié)構(gòu)，MG-63細(xì)胞完全布滿培養(yǎng)瓶底。
　　 1.2間接共培養(yǎng)對MG-63細(xì)胞分化的作用：MG-63細(xì)胞在與HUVECs細(xì)胞間接共培養(yǎng)環(huán)境下，其Collagen I mRNA表達(dá)明顯增加，24h共培養(yǎng)組MG-63細(xì)胞所表達(dá)的Collagen I mRNA為對照組的1.32，(P<0.05)；48h達(dá)到最大值，為對照組的1.57，(P<0.01)。培養(yǎng)液中OC表達(dá)隨時間增加，且共培養(yǎng)組明顯高于對照

14、組，24h，共培養(yǎng)組培養(yǎng)清液中OC含量為對照組的1.54，(P<0.01)；48h為對照組的1.48，(P<0.01)；72h為對照組1.35，(P<0.05)。
　　 2.CGRP對間接共培養(yǎng)體系中MG-63細(xì)胞的生物學(xué)作用：
　　 不同濃度的CGRP作用MG-63-HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)體系48h后，MG-63細(xì)胞的Collagen I mRNA和OC表達(dá)均有所增加，以10nM濃度組的MG.63細(xì)胞Collagen

15、ImRNA和OC表達(dá)增高最為明顯，分別為對照組1.94(P<0.01)和2.02(P<0.01)。
　　 10nM濃度CGRP作用MG-63-HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)體系，MG-63細(xì)胞Collagen ImRNA表達(dá)呈現(xiàn)增加趨勢，Collagen I mRNA表達(dá)于48h達(dá)到峰值，為對照組的1.98，(P<0.01)；培養(yǎng)液中的OC含量自24h后呈現(xiàn)增加趨勢(P<0.01)，培養(yǎng)液中的OC含量于96h達(dá)到峰值，為對照組的2.91

16、。
　　 3.共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的VEGF-A調(diào)控機制：
　　 3.1共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的VEGF-A分泌變化：
　　 在10nM CGRP的作用下，HUVECs單獨作用組中培養(yǎng)液中VEGF-A含量相對對照組顯著上升，在48h達(dá)到峰值，為對照組的2.31，VEGF-AmRNA相對對照組顯著上升，在24h達(dá)到峰值，為對照組的2.71；MG-63單獨作用組中培養(yǎng)液中的VEGF-A的含量在36h后隨著時

17、間延長出現(xiàn)下降，在48h達(dá)到最低值，為對照組的0.66；CGRP干預(yù)共培養(yǎng)組中，HUVECs細(xì)胞VEGF-A mRNA表達(dá)在24h后出現(xiàn)顯著增高，24h達(dá)到峰值，為對照組的2.42。
　　 3.2共培養(yǎng)體系中CGRP所誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞VEGF受體表達(dá)變化：
　　 CGRP升高了共培養(yǎng)體系中MG-63細(xì)胞中VEGFR1的表達(dá)，10nM CGRP作用48h后，通過交叉對比，CO組VEGFR1表達(dá)顯著高于CON組，0.18

18、6:0.124(p<0.01)；EXP組VEGFR1表達(dá)顯著高于CON組，0.201:0.124(p<0.01)，并顯著高于CGRP組，0.201:0.118(p<0.01)。
　　 CGRP和共培養(yǎng)環(huán)境分別升高了MG-63細(xì)胞中VEGFR2的表達(dá)，10nM CPGR作用48h后，通過交叉對比，CGRP組和CO組均顯VEGFR2表達(dá)著高于CON組，分別為0.177:0.081(p<0.01)和0.154:0.081(p<0.01

19、)；EXP組VEGFR2表達(dá)顯著高于CON組，0.194:0.081(p<0.01)，并顯著高于CO組，0.194:0.154(p<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.MG-63細(xì)胞與HUVECs細(xì)胞能夠在高糖DMEM培養(yǎng)基中直接共培養(yǎng)，其中以1:1比例為優(yōu)勢比例；血管內(nèi)皮細(xì)胞呈結(jié)節(jié)樣生長，隨時間延長有出現(xiàn)管型樣結(jié)構(gòu)的趨勢，MG-63細(xì)胞在其周圍生長。
　　 2.MG-63-HUVECs間接共培養(yǎng)環(huán)境下，Coll

20、egen I mRNA表達(dá)和分泌型OC增加，促進(jìn)MG-63細(xì)胞的分化成熟。
　　 3.CGRP對共培養(yǎng)體系中MG-63細(xì)胞Collagen I mRNA和OC表達(dá)具有顯著地促進(jìn)作用，以10nM為最佳濃度，CGRP和共培養(yǎng)兩種方式均能促進(jìn)MG-63細(xì)胞Collagen I mRNA和OC表達(dá)，促進(jìn)MG-63細(xì)胞分化成熟。
　　 4.CGRP能夠促進(jìn)MG-63-HUVECs共培養(yǎng)體系中HUVECs細(xì)胞表達(dá)VEGF-AmRNA