BMP-2在降鈣素基因相關(guān)肽調(diào)控MG63細(xì)胞增殖分化中的作用.pdf

1、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)被證實(shí)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化活性,已知的CGRP信號(hào)調(diào)控通路包括了:胞內(nèi)鈣離子通道(Ca2+)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)等。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)也同樣擁有誘導(dǎo)成骨的能力。骨髓基質(zhì)細(xì)胞在有BMP-2參與的基礎(chǔ)上,通過旁分泌和自分泌作用,在細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)

2、傳導(dǎo)信息,刺激DNA的合成和細(xì)胞的復(fù)制,促進(jìn)成骨細(xì)胞前體的增殖,誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,提高干細(xì)胞的成骨表型和成骨能力,增強(qiáng)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)的活性,促進(jìn)細(xì)胞間的粘附和成骨細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá)。目前已知的BMP對(duì)成骨細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)主要包括有Smad,P38MAPK通路。
　　目前的研究發(fā)現(xiàn):BMP-2,4,6可以促進(jìn)神經(jīng)分泌CGRP,CGRP在體外促進(jìn)牙髓細(xì)胞分

3、泌BMP-2,BMP-2體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨組織中CGRP的神經(jīng)可以再生分布,BMP-2在腹腔注射CGRP的大鼠脛骨骨折愈合的骨痂中高表達(dá),CGRP在體外協(xié)同增加BMP-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖的能力。這些研究結(jié)果提示:CGRP可以誘導(dǎo)骨組織中BMP-2的表達(dá)增加,但兩者之間相互作用的信號(hào)通路機(jī)制目前尚不清楚,因此推測CGRP的促成骨作用可能與BMP-2的表達(dá)有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)CGRP促成骨細(xì)胞增殖、分化作用中BMP信號(hào)通路所發(fā)揮的作用;CGR

4、P促成骨細(xì)胞BMP-2表達(dá)的影響及其機(jī)制等進(jìn)行研究。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng):人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)接種于培養(yǎng)瓶(100ml)中傳代培養(yǎng)(5×106個(gè)/cm2),培養(yǎng)基為RPMI1640(含10％FBS),放置于5%CO2孵箱中37°C孵育72h傳代,傳代至6-7代時(shí)使用。
　　2、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用:
　　2.1、MG63細(xì)胞增殖:MTT法檢

5、測CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖的調(diào)控作用;流式細(xì)胞儀檢測CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖周期的調(diào)控。設(shè)定量效作用的濃度為(10–10-10–7M),時(shí)效作用為(24-72h)。
　　2.2、MG63細(xì)胞分化:PNPP偶氮法檢測CGRP對(duì)MG63細(xì)胞ALP染色的調(diào)控作用;Westernblot檢測CGRP對(duì)MG63細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、骨鈣素(OCN)表達(dá)的調(diào)控作用。設(shè)定量效作用的濃度為(10–10-10

6、–7M),時(shí)效作用為(24-72h)。免疫熒光染色檢測10-8MCGRP對(duì)MG63(48h)ALP表達(dá)的作用。
　　3、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖、分化調(diào)控中BMP信號(hào)通路的作用:
　　3.1、分組:10-8MCGRP;10-8MCGRP+100ng/mlNoggin;100ng/mlNoggin;空白對(duì)照組,作用時(shí)間為48h。
　　3.2、MG63細(xì)胞增殖影響:流式細(xì)胞儀檢測MG63細(xì)胞增殖周期。
　　3.3、

7、MG63細(xì)胞分化影響:免疫熒光染色檢測MG63細(xì)胞的ALP表達(dá);Westernblot檢測MG63細(xì)胞的ALP,ColIaⅠ和OCN蛋白表達(dá)。
　　4、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP-2的調(diào)控作用:
　　4.1、RT-PCR檢測CGRP對(duì)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP-2mRNA的調(diào)控作用:設(shè)定量效作用的濃度為(10–10-10–7M),時(shí)效作用為(1-48h)。
　　4.2、CGRP促進(jìn)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP-2中Nogg

8、in的作用:
　　分組:10-8MCGRP;10-8MCGRP+100ng/mlNoggin;100ng/mlNoggin;空白對(duì)照組,作用時(shí)間48h。
　　RT-PCR檢測MG63細(xì)胞BMP-2mRNA的表達(dá);Westernblot檢測MG63細(xì)胞BMP-2蛋白的表達(dá)。
　　5、CGRP促進(jìn)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP-2的機(jī)制:
　　5.1、分組:10-8MCGRP、10-8MCGRP+5μMH-89、5μMH-8

9、9、空白對(duì)照組,作用時(shí)間48h。
　　5.2、免疫檢測試劑盒檢測MG63細(xì)胞cAMP表達(dá);RT-PCR檢測MG63細(xì)胞BMP-2mRNA表達(dá);Westernblot檢測MG63細(xì)胞BMP-2、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)、磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(PhosphorylatedCampResponseElementBindingProtein,pC

10、REB)的表達(dá)。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析:
　　所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,應(yīng)用Dunnett,s檢驗(yàn)中的t檢驗(yàn)和方差分析,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分別設(shè)定p<0.05以及p<0.01表明有顯著性差異和差異非常顯著。
　　結(jié)果：
　　1、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控作用:
　　1.1、MG63細(xì)胞增殖:MTT法檢測發(fā)現(xiàn)CGRP加入MG63細(xì)胞培養(yǎng)基中24-72h的時(shí)間段中,CGRP各濃度組的細(xì)胞數(shù)均顯

11、著高于空白對(duì)照組(P<0.05),其中以10-8MCGRP濃度組最為明顯(P<0.05);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖周期發(fā)現(xiàn)不同濃度的CGRP都加速了細(xì)胞周期循環(huán),但是以48h10-8M組最為明顯(P<0.05),48h以后有下降趨勢。
　　1.2、MG63細(xì)胞分化:PNPP偶氮法檢測發(fā)現(xiàn)各濃度組的CGRP促進(jìn)MG63細(xì)胞的ALP表達(dá)量均高于空白對(duì)照組,其中以72h10-8M組最為明顯(P<0.05),時(shí)效對(duì)比中發(fā)現(xiàn)各濃度組細(xì)胞的AL

12、P表達(dá)量在72h較48h增加不明顯(P>0.05);蛋白定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組的ALP,ColIaⅠ和OCN蛋白表達(dá)量均高于空白對(duì)照組(P<0.05),其中以48h10-8M組最為明顯(P<0.05);免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)48h10-8M組熒光數(shù)目較空白對(duì)照組多。
　　2、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞增殖、分化調(diào)控中BMP信號(hào)通路的作用:
　　2.1、MG63細(xì)胞增殖:流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)CGRP組和CGRP+Noggin組的S+

13、G2期細(xì)胞的數(shù)目高于空白對(duì)照組(p<0.05),但是CGRP組和CGRP+Noggin組之間沒有明顯差異。
　　2.2、MG63細(xì)胞分化:Wstern-blot檢測CGRP組ALP,ColIaⅠ和OCN蛋白的表達(dá)量高于空白對(duì)照組(p<0.05);CGRP+Noggin組低于CGRP組(p<0.05)。
　　3、CGRP對(duì)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP-2的調(diào)控作用:
　　3.1、PCR檢測發(fā)現(xiàn)8-24小時(shí)內(nèi)只有10-8M、10

14、-7M組可以檢測到BMP-2mRNA的表達(dá),且10-7M組明顯高于10-8M組(p<0.01);48h10-9M組可檢測到BMP-2mRNA表達(dá),但明顯低于48h10-8M、48h10-7M兩組(p<0.01)。
　　3.2、10-8MCGRP作用48h,MG63細(xì)胞BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)量,CGRP組高于空白對(duì)照組和Noggin組(P<0.01),CGRP+Noggin組與CGRP組無差異。
　　4、CGRP促進(jìn)M

15、G63細(xì)胞表達(dá)BMP-2的機(jī)制:
　　4.1、MG63細(xì)胞cAMP含量檢測發(fā)現(xiàn),CGRP組和CGRP+H-89組均高于空白對(duì)照組(P<0.01),但是前兩組之間無顯著差異。
　　4.2、CGRP、CGRP+H-89、H-89和空白對(duì)照組的CREB表達(dá)量無顯著差異。
　　4.3、CGRP組的pCREB蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P<0.01),但是CGRP+H-89組明顯低于CGRP組(P<0.01)。
　　4.4、

16、CGRP組的BMP-2mRNA和蛋白表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P<0.01),但是CGRP+H-89組明顯低于CGRP組(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、CGRP促進(jìn)MG63細(xì)胞的增殖與分化,并且具有時(shí)間以及劑量依賴性,優(yōu)勢濃度為10-8M,優(yōu)勢時(shí)段為48h。
　　2、CGRP可能通過BMP-2途徑促進(jìn)MG63細(xì)胞的分化,而不通過BMP-2途徑促進(jìn)MG63細(xì)胞的增殖。
　　3、CGRP促進(jìn)MG63細(xì)胞表達(dá)BMP