血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控及膜聯(lián)蛋白A7促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬作用的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 巨自噬(以下簡稱自噬)是真核細(xì)胞中一種保守的溶酶體依賴的降解機(jī)制。胞質(zhì)中內(nèi)源性的長壽命蛋白和多余或異常的細(xì)胞器被雙層膜包被，形成泡狀結(jié)構(gòu)，稱為自噬小體。后者與溶酶體或內(nèi)體發(fā)生質(zhì)膜融合。自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autophagolysosome)，溶酶體酸性水解酶將自噬溶酶體的內(nèi)膜和包含物降解成氨基酸、單糖、核苷酸等小分子，被細(xì)胞重新利用，從而實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和受損細(xì)胞器的清除。這一過程不僅僅

2、為細(xì)胞的基礎(chǔ)功能提供養(yǎng)料，同時在抵抗微生物侵入、蛋白錯誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、氧化壓力過程中提高細(xì)胞適應(yīng)性促進(jìn)存活。另一方面，自噬還是一種細(xì)胞死亡方式，稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，它有利于保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，清除有害物質(zhì)，維持機(jī)體穩(wěn)定和更新。越來越多的實驗證據(jù)表明自噬參與許多重大疾病，包括神經(jīng)退行性病變、腫瘤、動脈粥樣硬化和老化等，因此自噬研究具有極為重要的病理生理學(xué)意義。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在血管內(nèi)膜表面并且相互緊密連接的單層細(xì)胞，

3、它有效地將血液和血管壁分隔開來。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有信息傳遞、內(nèi)分泌、參與凝血、炎癥反應(yīng)和血管生成等多種重要的生理功能。因內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂而引起的高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭、腦卒中等疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。維持內(nèi)皮細(xì)胞正常功能具有重大臨床意義。目前越來越多的研究關(guān)注于自噬及其調(diào)控在血管內(nèi)皮細(xì)胞正常生理功能中發(fā)揮的作用，那么血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的內(nèi)在分子機(jī)制是什么?啟動血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的分子開關(guān)到底有哪些?它們是否參與經(jīng)典的自噬信號通

4、路呢?這些都有待于進(jìn)一步深入研究。
　　 膜聯(lián)蛋白(Annexins)是廣泛存在于動植物中的一類Ca2+調(diào)節(jié)的，與帶負(fù)電荷膜磷脂相結(jié)合的一類保守的蛋白超家族。在細(xì)胞中參與膜轉(zhuǎn)運和膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動，包括囊泡運輸、胞吐作用中的質(zhì)膜融合、信號傳導(dǎo)和鈣離子通道的形成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用等。目前已知Annexin家族成員約有20多種，分A、B、C、D、E五大類。所有Annexin超家族成員均具有一

5、個保守的中心結(jié)構(gòu)域(core domain)和一個發(fā)揮各自獨特功能的N端結(jié)構(gòu)域。其中心結(jié)構(gòu)域為含有重復(fù)序列的保守結(jié)構(gòu)，由4個同源的重復(fù)序列(annexin A6含有8個同源的重復(fù)序列)組成，每個重復(fù)序列含有70～80個氨基酸殘基組成的5個α螺旋，排列成彎曲的盤狀。Annexin的N端均含有鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族共有的鈣結(jié)合位點和磷酸化位點。腫瘤抑制基因annexin A7(ANXA7)定位與染色體10q21上，轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過不同的剪切形

6、成兩種異形體，分子量分別是47 kD和51 kD。ANXA7與鈣離子和磷脂結(jié)合發(fā)揮Ca2+激活的GTPase活性參與質(zhì)膜融合。二型肺泡細(xì)胞在分泌表面活性物質(zhì)時需要片層體與細(xì)胞質(zhì)膜融合。信號脂類，如甘油二脂(DAG)和磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PIP2)可以調(diào)節(jié)ANXA7的質(zhì)膜融合特性。分離的片層體用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)或磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)處理后，ANXA7的融合活性明顯增強。
　　 本論

7、文利用化學(xué)遺傳學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的調(diào)控，探討膜聯(lián)蛋白ANXA7在內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用，并進(jìn)一步揭示ANXA7在自噬調(diào)控中的分子機(jī)理。從而深化對血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬機(jī)制的認(rèn)識，為自噬調(diào)控提供新的有效的工具，并為臨床診療新策略提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　 研究內(nèi)容：
　　 1.在去除血清和生長因子條件下低濃度鎘離子(Cd2+，<10μM)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)自噬并抑制細(xì)胞凋亡作用。

8、>　　 2.低濃度鎘離子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的作用機(jī)理。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO誘導(dǎo)正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。
　　 4.ANXA7在ABO誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用。
　　 5.ABO參與自噬調(diào)控的分子機(jī)理。
　　 研究方法：
　　 1.血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：參考Jatfe等的方法(Jaffe et al.，1973)。
　　 2.細(xì)胞自噬和自噬流的檢測：
　

9、　 1)吖啶橙染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞中酸性膜泡的數(shù)量及分布。
　　 2)吖啶橙染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞中酸性膜泡的數(shù)量。
　　 3)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測自噬標(biāo)志物MAP1 LC3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定量和分布。
　　 4)利用Western blot法檢測LC3-Ⅱ、beclin1和p62的蛋白水平分析自噬小體的數(shù)量以及自噬流的完整性。
　　 5)利用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin誘導(dǎo)自噬以檢測A

10、BO引發(fā)的自噬和自噬流。
　　 6)利用自噬抑制劑3MA、bafilomycin Al以檢測ABO引發(fā)的自噬和自噬流。
　　 7)利用Western blot法檢測mTOR信號通路的下游靶點p70S6K和4EBP1的磷酸化情況。
　　 3.細(xì)胞凋亡檢測：
　　 1)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2)吖啶橙染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核凝集及片斷化。
　　 3)利用TUNE

11、L方法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 4.磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)活性檢測：參考吳興中等人的方法(Wuet al.，1997)。
　　 5.利用RNA干擾技術(shù)降低蛋白表達(dá)水平：利用化學(xué)合成的siRNA特異性阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞中ANXA7的表達(dá)。
　　 6.利用真核細(xì)胞過表達(dá)系統(tǒng)特異性上調(diào)蛋白表達(dá)：
　　 1)利用含annexin A7全長的表達(dá)載體pCMV6-XL5-ANXA7特異性上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞

12、中ANXA7的蛋白表達(dá)水平。
　　 2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ANXA7蛋白水平。
　　 3)Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)ANXA7蛋白水平。
　　 7.活性氧(ROS)檢測：利用熒光探針DCHF結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROS水平。
　　 8.線粒體膜電位(MMP)檢測：利用熒光探針JC-1結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測MMP水平。
　　 9.細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平及分布檢測：

13、　　 1)利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ANXA7、膜整聯(lián)蛋白integrinβ4、caveolin-1的蛋白表達(dá)水平及分布。
　　 2)利用RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)ANXA7、GAPDH的mRNA水平。
　　 3)利用Western blot方法檢測LC3、beclin1、p62、ANXA7、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1、GAPDH、β-actin的蛋白表達(dá)水平。<

14、br>　　 研究結(jié)果：
　　 1.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬并抑制因去除血清和生長因子引起的細(xì)胞凋亡
　　 1.1利用熒光探針檢測鎘離子進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示細(xì)胞中熒光強度隨鎘離子的濃度升高而升高，具有明顯的劑量依賴性。單純探針本身僅顯示微弱的熒光信號(圖1.1)。
　　 1.2倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示1、5、10μM鎘離子處理24 h有效地減弱了由于去除血清和生長因子引起的內(nèi)皮細(xì)胞從

15、培養(yǎng)皿上脫離(圖1-2)。
　　 1.3 TUNEL實驗結(jié)果表明去除血清和生長因子明顯引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂。鎘離子處理后TUNEL陽性率明顯降低，但10μM鎘離子的作用有所減弱，TUNEL陽性率出現(xiàn)一定的回升(圖1-3)。
　　 1.4在去除血清和生長因子條件下，吖啶橙染色顯示低濃度的鎘離子引起細(xì)胞內(nèi)的酸性膜泡增多(圖1-4)，提示細(xì)胞自噬增強的可能性。
　　 1.5 Western blot結(jié)果表明

16、自噬標(biāo)記物MAPl LC3-Ⅱ的蛋白含量增多(圖1-5)，表明自噬小體增多，自噬增強。
　　 2.低濃度鎘離子(Cd2+)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬并抑制其凋亡的分子機(jī)制研究
　　 2.1分別用0、1、5、10μM鎘離子處理用不含血清和生長因子培養(yǎng)液培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞4 h，接著用DCHF熒光探針檢測細(xì)胞中的ROS水平。結(jié)果顯示
　　 5、10μM鎘離子處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中探針熒光強度增強，細(xì)胞ROS水平升高(圖1-6

17、)。
　　 2.2在去除血清與生長因子的條件下，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果表明低濃度的鎘離子降低了內(nèi)皮細(xì)胞整聯(lián)蛋白integrinβ4的含量，隨著鎘離子濃度的增高integrinβ4降低程度逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1-7)。
　　 2.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測細(xì)胞內(nèi)小窩蛋白caveolin-1的表達(dá)水平，不同濃度的鎘離子明顯降低caveolin-1水平，其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-8)。
　　 2.4在

18、去除血清與生長因子的條件下，不同濃度的鎘離子明顯降低細(xì)胞內(nèi)PC-PLC活性，其中5μM鎘離子效果最顯著(圖1-9)。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO誘導(dǎo)正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬
　　 3.1應(yīng)用不同濃度的苯并噁嗪衍生物ABO(10、25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，吖啶橙染色結(jié)果顯示胞質(zhì)內(nèi)酸性膜泡增多。提前加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)處理抑制50μM AB

19、O引起的酸性膜泡數(shù)量增多(圖2-2A)。用流式細(xì)胞儀檢測表明ABO將細(xì)胞內(nèi)的吖啶橙熒光強度由對照組的3％左右提高到50％以上(圖2-2B)。
　　 3.2小分子ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24小時，將細(xì)胞固定后制成切片應(yīng)用于透射電鏡觀察。ABO處理組中直徑500 nm左右的雙層膜泡數(shù)量增多(圖2-3，*所示)，表明自噬小體增多。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理相對減少了雙層膜結(jié)構(gòu)的數(shù)量，進(jìn)一步確證該雙層膜結(jié)構(gòu)為自噬小體。
　　 3.

20、3利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中的自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAPI LC3)。ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯點狀簇集，表明LC3轉(zhuǎn)移到自噬小體膜上，提示自噬小體形成。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理有效減少了LC3陽性膜泡的數(shù)量，抑制ABO誘導(dǎo)的自噬作用(圖2-4)。
　　 3.4小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞全蛋白，Western

21、 blot方法檢測LC3和自噬底物p62/SQSTM1的蛋白水平。隨著ABO濃度升高，與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合的LC3-Ⅱ的含量逐漸升高，自噬底物p62的降解增加，細(xì)胞內(nèi)含量減少。自噬抑制劑3-MA預(yù)先處理有效抑制LC3-Ⅱ的上調(diào)和p62的下調(diào)(圖2-5)。
　　 3.5利用50μMABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞0、6、12、24 h后提取細(xì)胞全蛋白檢測LC3的蛋白水平，利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)作為陽性對照。在此時

22、間區(qū)段中，隨著時間的延長細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的含量逐漸升高，在24 h達(dá)到相對最高值(圖2-6)。
　　 3.6小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞全蛋白，Western blot方法檢測自噬另一標(biāo)志性蛋白beclin1的水平。結(jié)果顯示beclin1蛋白被小分子ABO上調(diào)，該作用可以被自噬抑制劑3-MA抑制(圖2-7)。
　　 3.7利用巴弗洛霉素Al(bafilomycin Al)抑制自

23、噬溶酶體中蛋白酶的活性而阻斷自噬流，進(jìn)一步加入50μM小分子化合物ABO處理24 h，結(jié)果顯示ABO可以進(jìn)一步增強巴弗洛霉素Al對LC3-Ⅱ的積累作用，說明ABO不是阻斷自噬小體的降解，而是促進(jìn)自噬小體的生成(圖2-8)。
　　 4.膜聯(lián)蛋白ANXA7在ABO誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用
　　 4.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24h后提取細(xì)胞全蛋白，Western blot方法檢測膜聯(lián)蛋白ANXA

24、7的水平。隨著ABO濃度升高，ANXA7的蛋白水平被逐漸上調(diào)(圖2-9A)。利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法檢測mRNA水平，結(jié)果顯示ABO提高ANXA7的基因表達(dá)水平(圖2-9B)。用50μM ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞0、6、12、24 h后ANXA7蛋白水平升高，并呈現(xiàn)出時間依賴趨勢(圖2-9C)。利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)50μM小分子ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后ANXA7在細(xì)胞內(nèi)含量升高，且呈現(xiàn)出點狀

25、簇集分布的狀態(tài)(圖2-9D)。
　　 4.2利用不同濃度的ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7，10、20、40 nM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24、48、72 h，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示ANXA7的表達(dá)被有效抑制。在隨后的實驗中選擇40 nM處理24 h作為實驗條件(圖2-10A)。利用不同濃度的siANXA7(10、20、40 nM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后提取全蛋白，Western blot檢測.ANXA7蛋白水平。隨著si

26、ANXA7濃度的增高，ANXA7蛋白水平逐漸降低，其中40 nM效果最明顯，確證該實驗條件有效干擾細(xì)胞內(nèi)ANXA7蛋白表達(dá)(圖2-10B)。
　　 4.3通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)合RNA干擾技術(shù)(RNAi)研究膜聯(lián)蛋白ANXA7和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3的定位情況。血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用無意義RNA(scrambleRNA，Scr)、ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理后，先后使用LC3和ANXA7抗體標(biāo)記兩種蛋白。激光共聚焦顯微

27、鏡觀察結(jié)果顯示：在對照組和無意義RNA處理組，ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后LC3出現(xiàn)點狀簇集，同時胞質(zhì)內(nèi)ANXA7與LC3發(fā)生一定的共定位。而將ANXA7干擾掉之后，LC3點狀簇集的數(shù)量明顯減少。結(jié)果表明ANXA7在ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖2-11)。
　　 4.4利用40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，不同濃度小分子ABO(25、50、100μM)繼續(xù)

28、處理24 h。吖啶橙染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：在對照組和無意義RNA處理組，ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，細(xì)胞內(nèi)酸性膜泡數(shù)量明顯增多，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴趨勢。將ANXA7干擾掉之后，ABO處理細(xì)胞的酸性膜泡數(shù)量相對減少(圖2-12)。
　　 4.5利用40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24 h，ABO(50μM)繼續(xù)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞全蛋白，Western blot方法檢測AN

29、XA7和LC3-Ⅱ蛋白含量。結(jié)果顯示在無意義RNA組中ABO明顯上調(diào)ANXA7和自噬蛋白LC3-Ⅱ的蛋白含量：在siANXA7組中ANXA7含量減少，同時LC3-Ⅱ的蛋白含量相對明顯減少。表明ANXA7在ABO誘導(dǎo)的自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖2.13)。
　　 4.6利用蛋白質(zhì)過表達(dá)系統(tǒng)研究ANXA7過表達(dá)對自噬的影響。血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000，空質(zhì)粒pCMV6-XL5，帶有ANXA7全長序列的pCMV6-XL5-

30、ANXA7質(zhì)粒處理后提取細(xì)胞全蛋白，Western blot方法檢測ANXA7和LC3-Ⅱ的蛋白含量。結(jié)果顯示pCMV6-XL5-ANXA7處理組中ANXA7含量增高，LC3-Ⅱ含量明顯升高?？召|(zhì)粒組中LC3-Ⅱ含量輕微升高，可能與空質(zhì)粒刺激細(xì)胞產(chǎn)生一定的細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)(圖2-14)。
　　 5.膜聯(lián)蛋白ANXA7調(diào)控的白噬不參與經(jīng)典的mTOR信號通路
　　 5.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24

31、 h提取細(xì)胞全蛋白，Western blot方法檢測經(jīng)典的自噬信號通路哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)的下游分子p70S6K和4EBP1的磷酸化。雷帕霉素可以減低二者的磷酸化水平，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生。Western blot結(jié)果顯示ABO處理后p70S6K和4EBP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15A)。用50μM ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞0、6、12、24 h后提取細(xì)胞全蛋白，Western blot結(jié)果顯示在此時間區(qū)間p70S6K和4E

32、BP1的磷酸化狀態(tài)沒有改變(圖2-15B)。表明ABO和ANXA7誘導(dǎo)的自噬是不依賴于mTOR信號通路的。
　　 5.2分別用Scramble RNA和40 nM ANXA7特異性干擾RNA(siANXA7)處理24 h，加入雷帕霉素處理血管內(nèi)皮細(xì)胞8 h，提取細(xì)胞全蛋白檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ和自噬底物p62的蛋白水平。雷帕霉素處理的對照組、無意義RNA組和siANXA7組中，雷帕霉素均可以明顯提高LC3-Ⅱ，降低p62的水平

33、，說明ANXA7不參與雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬(圖2-16)。
　　 6.苯并噁嗪衍生物ABO處理內(nèi)皮細(xì)胞后ROS、MMP沒有變化
　　 6.1小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，利用熒光探針DCHF檢測活性氧(ROS)變化。結(jié)果顯示ABO不影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平(圖2-17A)。與ABO相反，小分子DBO(6，8-dichloro-2，3-dihydro-3-hydroxymethyl-1，4-be

34、nzoxazine)提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)先處理可以有效抑制ROS水平的升高(圖2-17B)。Western blot檢測結(jié)果表明：NAC清除細(xì)胞內(nèi)ROS后，DBO誘導(dǎo)的自噬被明顯抑制，說明小分子DBO是通過ROS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的(圖2-17C)。
　　 6.2小分子ABO(25、50、100μM)處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，利用熒光探針JC-1檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A

35、BO不影響細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平(圖2-18)。
　　 結(jié)論：
　　 1.低濃度鎘離子誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制因去除血清和生長因子而誘發(fā)的凋亡作用。此過程中ROS水平升高，integrinβ4、caveolinl水平和PC-PLC活性降低。
　　 2.苯并噁嗪衍生物ABO激活血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬作用。
　　 3.苯并噁嗪衍生物ABO通過上調(diào)膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)的水平激活自噬，ANXA7在ABO