Hippo在降鈣素基因相關(guān)肽調(diào)控小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化中的作用.pdf

1、目的:骨折愈合是一個復(fù)雜有序的過程，涉及諸多生物因子，如肽能神經(jīng)遞質(zhì)。降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一種在機(jī)體多個組織器官內(nèi)表達(dá)最廣泛的神經(jīng)多肽，已被證實具有促進(jìn)骨折后重塑的生物學(xué)功能，它的受體復(fù)合物包括:降鈣素受體樣受體(Calcitonin receptor like receptor，CRLR)、受體活性修飾蛋白（Receptor activity modifying

2、 protein，RAMP）、受體組分蛋白(Receptor componentprotein，RCP)。早在1987年就有研究報道，骨折合并中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者，愈合時間比正常短;而合并周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者，愈合時間明顯延長。之后的研究發(fā)現(xiàn)，骨折患者血漿中CGRP濃度增加，骨折局部含CGRP的神經(jīng)元數(shù)目明顯增多。本課題組前期研究已經(jīng)證實，CGRP可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨折修復(fù)，許多信號途徑如cAMP/PK

3、A、RANKL、BMP、NO/NOS等都參與了CGRP對骨折愈合過程的調(diào)控。但CGRP對成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞—骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)的成骨功能調(diào)控如何以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究還鮮有報道。BMSCs來源于中胚層，具有容易分離培養(yǎng)、可塑性強(qiáng)、可多向分化、能夠在體外快速擴(kuò)增等優(yōu)點，在骨組織工程中受到高度關(guān)注。有學(xué)者通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)小鼠BMSCs表面存在著CRLR和RA

4、MP。同時，mRNA及蛋白水平檢測也證實了人BMSCs表面存在CGRP受體。
　　Hippo信號通路具有高度保守性，對細(xì)胞調(diào)控的生物學(xué)功能表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Hippo通路的三大組成部分包括:上游信號分子（Ex，Mer等）、核心激酶級聯(lián)反應(yīng)鏈（Mst1/2、Lats1/2、Sav等）、下游效應(yīng)分子(Yap/Taz)。上游分子接收并傳遞外界信號，激活核心激酶鏈的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，引起Yap/Taz的活性改變和核/質(zhì)轉(zhuǎn)位，

5、最終激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白表達(dá)。Hippo通路在哺乳動物中的驗證開始于小鼠肝臟。研究人員過表達(dá)小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)的Yap基因后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖加快，肝臟體積達(dá)到正常肝臟的3-4倍。抑制Yap的表達(dá)后，肝細(xì)胞凋亡水平升高，肝臟最終恢復(fù)至正常大小。有報道指出，Mst1/2和Savl在維持肝細(xì)胞靜態(tài)和小鼠出生后限制肝臟生長具有重要作用。另外，值得注意的是，該通路在胚胎發(fā)育過程及成體干細(xì)胞分化命運決定中也發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。
　　

6、綜上所述，本文旨在進(jìn)一步揭示CGRP在骨折愈合中的作用，研究CGRP對小鼠BMSCs增殖及成骨分化的影響，并對Hippo通路在這個過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行初步探討。
　　方法:1、體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代Balb/c小鼠BMSCs。
　　2、在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMSCs中加入不同濃度的CGRP(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)，處理48 h后測試堿性磷酸酶(ALP)活性，篩選的優(yōu)勢濃度。
　　3、CG

7、RP處理BMSCs7d后進(jìn)行茜素紅染色，檢測細(xì)胞的成骨分化情況。
　　4、應(yīng)用Western blot檢測CGRP作用于BMSCs后，Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表達(dá)水平。
　　5、利用Hippo通路抑制劑維替泊芬(Verteporfin)阻斷下游Yap信號，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測其對成骨相關(guān)因子Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2) mRNA的表達(dá)影響。<

8、br>　　結(jié)果:1、成功分離并擴(kuò)增純化Balb/c小鼠BMSCs。
　　2、ALP活性檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，10-9、10-8、10-7 mol·L-1濃度范圍的CGRP都能顯著促進(jìn)小鼠ALP活性的增加(P＜0.05)，且以10-8 mol·L-1濃度的CGRP為最佳刺激濃度。
　　3、用10-8 mol·L-1濃度的CGRP處理后，茜素紅染色顯示鈣化結(jié)節(jié)明顯增多。CGRP能夠顯著上調(diào)p-Mst1/2蛋白的表達(dá)(P

9、＜0.05)。
　　4、當(dāng)運用了抑制劑Verteporfin時，顯著降低了CGRP誘導(dǎo)的Runx2、collagenⅠmRNA的表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、通過貼壁篩選的手段可成功從Balb/c小鼠下肢骨骨髓中獲得所需的BMSCs。
　　2、神經(jīng)肽CGRP能顯著地促進(jìn)小鼠BMSCs增殖和成骨分化，優(yōu)勢刺激濃度為10-8mol/L。
　　3、Hippo信號通路在CGRP促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化過程中起正