降鈣素基因相關(guān)肽抗高血壓內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老作用和機(jī)制的研究.pdf

1、第一章內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽和Klotho蛋白 內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是一群具有特異性歸巢于血管新生組織并能分化增殖為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的干細(xì)胞，在內(nèi)皮修復(fù)以及出生后血管新生中具有重要作用。大量研究表明，EPCs自分泌和旁分泌眾多的細(xì)胞因子參與維持自身功能的調(diào)節(jié)。 降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）作為一種重要的內(nèi)源性舒血管活性物質(zhì)，參與介導(dǎo)多種心血管保護(hù)作用。我們和其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮也能合成和分泌CGRP，參與內(nèi)

2、皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。 Klotho（K1）是另一重要內(nèi)源性活性物質(zhì)，具有抗衰老等生物學(xué)效應(yīng)，在維持血管內(nèi)皮功能方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，重組K1蛋白可明顯抑制內(nèi)皮凋亡，提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)多種刺激因素的耐受性。 鑒于EPCs是維持血管內(nèi)皮完整性和促進(jìn)血管新生的重要血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，且具有活躍的自分泌和旁分泌功能，本實(shí)驗(yàn)將分離培養(yǎng)人的外周和臍靜脈血EPCs，以探討其是否表達(dá)CGRP和K1蛋白。 方法：密度梯度離心法分離

3、人臍血和外周血的單個(gè)核細(xì)胞，利用EGM-2細(xì)胞培養(yǎng)基（含EPCs分化所需各種生長(zhǎng)因子）進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞貼壁向EPCs分化。 結(jié)果：（1）臍血和外周血單個(gè)核細(xì)胞用EGM-2培養(yǎng)可分化成EPCs，具備典型的形態(tài)學(xué)和表型特征；（2）EPCs表達(dá)CGRP（兩種亞型）和Kl蛋白，以CGRPⅠ和分泌型K1為主；（3）CGRPⅠ和K1mRNA在EPCs分化中的表達(dá)時(shí)相一致，早期EPCs表達(dá)水平最高。 結(jié)論：EPCs（主要為早期

4、EPCs）能合成并分泌CGRP（以CGRPⅠ為主）和Klotho（以分泌型為主），二者之間的表達(dá)變化成正相關(guān)。 第二章降鈣素基因相關(guān)肽與高血壓內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老研究 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究證明，原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓動(dòng)物血中EPCs數(shù)量減少且功能降低，提示EPCs功能障礙可能是促進(jìn)高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高血壓狀態(tài)下，EPCsβ-半乳糖苷酶表達(dá)上調(diào)，端粒酶活性降低，衰老程度加劇，可能是導(dǎo)致EPCs功

5、能下調(diào)的重要原因。大量研究顯示，高血壓時(shí)壓力本身不是引起EPCs數(shù)目減少和功能障礙的直接因素，而可能與某些內(nèi)源性活性物質(zhì)水平異常有關(guān)，激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）可通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制，加速EPCs衰老，損害其功能。 近年研究證明，感覺(jué)神經(jīng)的主要遞質(zhì)CGRP合成與釋放減少與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道移植CGRP或腎上腺髓質(zhì)素（CGRP超家族另一種舒血管肽）高表達(dá)的EPCs可增強(qiáng)其促進(jìn)新生血管形成，降低肺動(dòng)脈壓力。基

6、于以上報(bào)道和之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（EPCs能合成與分泌CGRP，且CGRP的表達(dá)水平隨EPCs分化成熟而下降），我們推測(cè)高血壓EPCs衰老可能與CGRP水平下降有關(guān)。 EPCs衰老受多種因素影響。文獻(xiàn)報(bào)道，K1基因缺陷小鼠除了出現(xiàn)與人類(lèi)衰老相似表型外，其內(nèi)皮依賴(lài)性的血管舒張功能降低，外周血EPCs數(shù)目明顯減少，功能顯著受損。由于EPCs自身表達(dá)K1基因且其表達(dá)水平隨EPCs分化成熟而下降，我們推測(cè)K1基因可能參與介導(dǎo)高血壓EPCs衰老

7、。 由于CGRP和K1在EPCs分化成熟過(guò)程中的表達(dá)變化存正相關(guān)且兩者的免疫活性物質(zhì)在EPCs細(xì)胞內(nèi)的定位一致，本實(shí)驗(yàn)將探討：（1）CGRP和Klotho與高血壓EPCs衰老是否相關(guān)；（2）CGRP能否對(duì)抗高血壓時(shí)由于RAS系統(tǒng)激活引起的EPCs衰老加速，其機(jī)制是否涉及K1。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：臨床研究。分為2組：原發(fā)性高血壓患者和健康對(duì)照人群各20例。取外周靜脈血，測(cè)定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（E

8、LISA）；分離培養(yǎng)EPCs，檢測(cè)衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和端粒酶定量）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。分為2組：自發(fā)性高血壓大鼠與野生型WKY大鼠各20只。取全血，測(cè)定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（ELISA）；分離培養(yǎng)外周血來(lái)源EPCs，檢測(cè)衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和端粒酶定量）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三：體

9、外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。采用AngⅡ誘導(dǎo)EPCs衰老模型，外源性給予不同劑量的CGRP或構(gòu)建CGRP過(guò)表達(dá)的慢病毒感染EPCs，通過(guò)檢測(cè)β-半乳糖苷酶和端粒酶活性觀(guān)察CGRP抗EPCs衰老作用，并監(jiān)測(cè)K1基因mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）和蛋白表達(dá)（WesternBlot）的改變；進(jìn)一步用慢病毒介導(dǎo)miRRNA干擾技術(shù)阻斷K1表達(dá)，檢測(cè)CGRP抗EPCs衰老作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)K1蛋白生成所介導(dǎo)。 結(jié)果： （1）原發(fā)性高血壓患者血漿CGRP

10、和Klotho水平下降；外周血來(lái)源EPCsβ-半乳糖苷酶表達(dá)上調(diào)，端粒酶活性下降；EPCsCGRP和K1mRNA表達(dá)水平下降。 （2）自發(fā)性高血壓大鼠血漿CGRP和Klotho水平下降；外周血來(lái)源EPCsβ-半乳糖苷酶表達(dá)上調(diào)，端粒酶活性下降；EPCsCGRP和K1mRNA表達(dá)水平下降。 （3）給予AngⅡ能使EPCsβ-半乳糖苷酶活性增加、端粒酶活性下降和Klotho分泌型蛋白表達(dá)下降；外源性給予CGRP或過(guò)表達(dá)CGR

11、PⅠ能拮抗AngⅡ的作用，CGRP此作用可被CGRP受體阻斷劑CGRP8-37取消。 （4）慢病毒介導(dǎo)miR干擾阻斷Klotho表達(dá)能取消CGRP抗AngⅡ誘導(dǎo)的EPCs衰老作用。 結(jié)論： 高血壓EPCs衰老加速與體內(nèi)CGRP生成減少有關(guān)，CGRP的抗EPCs的衰老作用可能通過(guò)對(duì)抗氧化應(yīng)激促進(jìn)抗衰老基因Klotho的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。 第三章吳茱萸次堿抗高血壓內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的作用和機(jī)制研究 CGRP是辣椒

12、素敏感感覺(jué)神經(jīng)的主要遞質(zhì)，也是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的舒血管活性物質(zhì)。研究報(bào)道，原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠血中CGRP濃度顯著降低；α-CGRP基因敲除小鼠的基礎(chǔ)血壓增高，提示CGRP合成和釋放的減少可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。而且，我們前期的工作發(fā)現(xiàn)，高血壓EPCs衰老加速與體內(nèi)CGRP生成減少有關(guān)，給予外源性CGRP或CGRPⅠ過(guò)表達(dá)能有效抑制AngⅡ所致EPCs衰老，提示促進(jìn)CGRP合成與分泌是抑制高血壓EPCs衰老，改善E

13、PCs功能的有效途徑之一。 已知辣椒素受體（VR1，又稱(chēng)TRPV1）是體內(nèi)調(diào)節(jié)CGRP合成與釋放的關(guān)鍵受體，在體與離體的實(shí)驗(yàn)均表明，激動(dòng)TRPV1可促進(jìn)感覺(jué)神經(jīng)元合成CGRP及感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放CGRP。TRPV1除廣泛存在于感覺(jué)神經(jīng)元胞體及其神經(jīng)末梢外，也存在于內(nèi)皮細(xì)胞。因此，以TRPV1為靶點(diǎn)尋找促進(jìn)內(nèi)源性CGRP的合成或釋放的化合物，可能是開(kāi)發(fā)抗高血壓藥物的新途徑。 吳茱萸是一種傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分吳茱萸次堿（R

14、UT）表現(xiàn)為正性肌力與正性頻率，其作用可被TRPV1阻斷劑Capsazepine（CAPZ）和CGRP受體阻斷劑CGRP8-37所阻斷，提示其作用與激活TRPV1促進(jìn)CGRP釋放有關(guān)。我室新近研究證明，CGRP介導(dǎo)吳茱萸次堿的降壓并保護(hù)血管內(nèi)皮。因此，我們推測(cè)吳茱萸次堿可能通過(guò)激活TRPV1，促進(jìn)CGRP合成與釋放而抑制高血壓動(dòng)物EPCs衰老，改善EPCs功能。本實(shí)驗(yàn)將利用自發(fā)性高血壓動(dòng)物模型從整體和體外細(xì)胞水平探討吳茱萸次堿的這一作用

15、和機(jī)制，為吳茱萸次堿的臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分6組：野生型大鼠（WKY）組，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）組，RUT治療組（+RUT（10mg/kg）、+RUT（20mg/kg）和+RUT（40mg/kg》及陽(yáng)性藥物L(fēng)osartan治療組（+LOS（30mg/kg））。藥物每天灌胃給予，連續(xù)給藥2周。 取全血，測(cè)定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（ELISA）；分離

16、培養(yǎng)外周血和骨髓來(lái)源EPCs，檢測(cè)衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和TRAP-銀染法）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二：體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。分離培養(yǎng)人臍血來(lái)源EPCs，用10-7MAngⅡ誘導(dǎo)衰老，給予RUT（10-7～10-5M）預(yù)孵育細(xì)胞1h，48h后檢測(cè)EPCs衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和TRAP-銀染法）、CGRP和K1mRNA（實(shí)時(shí)定量PCR）表達(dá)、培養(yǎng)液上清CGRP含量（放射免疫法）和K1

17、分泌型蛋白表達(dá)（WesternBlot）。 結(jié)果： （1）RUT可劑量依賴(lài)性降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，增加血漿CGRP和Klotho水平；下調(diào)大鼠外周血和骨髓來(lái)源EPCsβ-半乳糖苷酶表達(dá)，提高端粒酶活性并上調(diào)CGRP和KlothomRNA表達(dá)。Losartan具有相似的作用。 （2）EPCs表達(dá)TRPV1mRNA和蛋白。 （3）給予AngⅡ能使EPCsβ-半乳糖苷酶活性增加、端粒酶活性下降和培養(yǎng)液上清C