2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、前言:
   糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病群,其引起的慢性并發(fā)癥可遍及全身各重要器官。糖尿病腎病(diateticnephropathy,DN)是主要的微血管病變之一,25%-40%的糖尿病患者20年內都會發(fā)生DN,是1型糖尿病(type1diabetesmellitus,T1DM)患者的主要死亡原因,己成為發(fā)達國家慢性腎衰竭的首要因素。
   DN的發(fā)病機制

2、非常復雜,尚未完全闡明。目前公認的是糖、脂代謝紊亂及其導致的血流動力學異常,兩者交互作用是DN發(fā)生的始動因素。糖代謝增強導致的反應性氧化應激,巨噬細胞活化引起的慢性炎癥是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素。腎小球高濾過和腎臟肥大是早期DN的特點,繼續(xù)發(fā)展則出現基底膜增厚,腎小球系膜增生,微量白蛋白尿,腎臟的重度炎性反應,腎小球硬化和小管間質纖維化等,導致終術期腎功能衰竭。
   目前對于DN尚缺乏有效的治療手段,臨床主要應用改善血壓和控制血

3、糖的藥物治療,必要時進行血液透析。這些療法均需終身性治療、費用昂貴,治療效果不理想,只能減慢并不能阻止DN的進程,不能起到保護腎臟和改善腎功等本質性作用。細胞治療是指利用細胞的某種特性,采用細胞工程方法使這些細胞具有免疫調節(jié)、殺滅病原體,促進組織再生和機體康復等治療效果,目前已成為治療疾病的有效手段。但細胞種類的選擇很關鍵,干細胞因具有自我更新、定向分化及免疫調節(jié)能力,是理想的種子細胞來源。胚胎干細胞很難獲得大量可定向分化的純度較高的種

4、子細胞,又涉及倫理學問題。因此目前真正用于組織構建、器官修復和細胞治療的種子細胞仍然是自體來源的成體干細胞。
   骨髓干細胞(bone marrowme senehymal cells,BMSCs)和脂肪干細胞(adipose deried stem cells,ADSCs)是研究較多的成體問充質干細胞。ADSCs除具有與BMSCs一致的自我更新、多向分化和免疫調節(jié)等干細胞特性外,還具有單位體積組織內干細胞含量大,取材簡單安全

5、、痛苦小等優(yōu)點。脂肪組織分布廣泛,不同部位脂肪組織來源的ADSCs也不盡相同。腹壁皮下脂肪組織取材方便無危險,由此獲得的ADSCs具有明顯的干細胞生物學特性,增殖能力強,具有實際應用價值。因此其作為ADSCs的代表,廣泛應用在組織工程和細胞治療等領域。大量研究表明ADSCs可以向多種組織、細胞分化。數據顯示ADSCs經基因改造技術、在化學藥物和細胞因子的誘導下,均可分化為胰島素分泌細胞(Insulin producing cells,I

6、PCs)。但基因技術的致突變性和化學藥物的致毒性都限制其應用于臨床,因此探討一種安全有效的誘導方式意義重大。
   研究表明BMSCs可以通過降低糖尿病大鼠的血糖,進而改善和治療DN,而有關ADSCs對DN的治療尚未見報道。但研究顯示ADSCs可以通過抑制氧化應激和炎癥反應來減輕大鼠腎缺血再灌注的損傷,ADSCs還能通過分化途徑改善大鼠的急性腎衰竭、保護腎臟,ADSCs對糖尿病大鼠視網膜病變也有改善和治療的作用。由此可見ADSC

7、s具有保護細胞免受損傷、促進病變組織再生修復的重要作用。同時,ADSCs及其分化的IPCs能降低糖尿病大鼠的血糖水平已被確認,結果顯示ADSCs具備治療DN的潛能,明確ADSCs對DN的治療效果及其作用機制意義重大。
   為了探討降糖作用對于DN的治療,是否具有主導地位,本實驗同時設立了ADSCs與IPCs兩個治療組。IPCs屬于定向分化了的細胞,喪失了干細胞的生物學特性,只具有明顯的降糖作用,因而可以作為攜帶降糖作用的單一因

8、素,有助于明確干細胞治療DN的作用機制。因此,本實驗擬通過腹腔注射鏈脲佐菌素(Strep to zotocin,STZ)制備大鼠DN模型,向DN大鼠體內分別移植熒光標記的ADSCs和IPCs,從腎臟的病理改變,血尿生化指標,氧化應激指標,炎癥因子及MAPK通路蛋白的表達等方面進行研究,比較ADSCs與IPCs對DN的改善及治療效果,探討應用細胞治療DN可能的作用機制,為臨床治療DN提供新思路。
   實驗材料與方法:
  

9、 一、實驗材料
   (一)實驗動物
   健康清潔級SD大鼠100只,體質量250-300g,雌雄不限,由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
   (二)主要試劑
   低糖DMEM、高糖DMEM、胎牛血清(Gibco),CD31-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE單克隆抗體(eBioscience),Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛

10、、β-甘油磷酸鈉、油紅O、L-脯氨酸、抗壞血酸、甲苯胺藍、STZ、PKH26(Sigma),GDF-5(PeproTeeh),細胞周期檢測試劑盒(凱基生物),尼克酰胺、活化素A、GLP-1(RD),大鼠胰島素、C肽ELISA酶聯免疫測定試劑盒(Mercodia),大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒、MDA測定試劑盒(南京建成)。
   二、實驗方法
   (一)大鼠ADSCs的分離培養(yǎng)與鑒定
 

11、  分離大鼠腹股溝皮下脂肪組織,培養(yǎng)脂肪干細胞,相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),MTT法檢測P3、P6、P9、P15細胞的增殖活性,流式細胞儀檢測細胞周期和表面抗原的表達。成骨、成軟骨、成脂肪誘導后分別行茜素紅、甲苯胺藍和油紅O染色進行鑒定。
   (二)體外誘導ADSCs分化為IPCs
   取P3的ADSCs接種到6孔板,分4組:NA,NG,AG,NAG;采用先高糖后低糖培養(yǎng)基的兩步誘導法培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,

12、雙硫腙染色鑒定IPCs內的鋅離子,ELISA法檢測IPCs對胰島素及C-肽的分泌量,RT-PCR檢測IPCs對胰島β細胞相關基因mRNA的表達。
   (三)ADSCs與IPCs移植治療大鼠DN
   STZ誘導SD大鼠制備DN模型,分別移植熒光標記的ADSCs和IPCs。熒光顯微鏡觀察標記細胞的定位,PAS染色檢測腎臟病理改變,檢測血尿生化指標、氧化應激指標、炎癥因子的表達,WesternBlotting檢測超氧化物歧

13、化酶及MAPK通路蛋白的表達。
   實驗結果:
   一、大鼠ADSCs的生物學特性
   SD大鼠的ADSCs類似成纖維細胞的長梭形,呈漩渦狀生長。MTT結果顯示ADSCs傳代培養(yǎng)P15后增殖能力仍未降低。細胞周期檢測發(fā)現ADSCs具有干細胞特性。流式細胞儀檢測結果顯示,ADSCs高表達間充質干細胞相關標志物CD90、CD44,不表達內皮細胞標記CD31,低表達CD49d,不表達CD106。成骨誘導后鈣結節(jié)形

14、成,茜素紅染色陽性;成軟骨誘導后分泌蛋白多糖,甲苯胺藍染色陽性;成脂誘導后脂滴形成,油紅O染色陽性。
   二、ADSCs誘導分化為IPCs
   ADSCs更換誘導培養(yǎng)液后細胞增殖緩慢,誘導21d時NAG組的細胞能形成胰島樣細胞團,雙硫腙染色陽性,并呈血糖濃度依賴性分泌胰島素及C肽。誘導14d時僅能檢測到PDXlmRNA,表明此時已分化出胰島前體細胞,誘導21d時NAG組細胞可表達GLUT1、INS、PDX1mRNA,

15、與正常大鼠胰島β細胞表達水平相近,明顯高于AG組。NAG組可以誘導ADSCs分化為有功能的IPCs。
   三、ADSCs與IPCs移植治療大鼠DN
   大鼠經STZ注射12w后,血尿生化指標發(fā)生明顯改變,符合DN模型標準。細胞移植4w后檢測發(fā)現,ADSCs能改善腎功的生化指標,并修復腎組織的病理改變,IPCs對其改善并不明顯。ADSCs和IPCs都能下調血糖水平,增加胰島素分泌量。ADSCs能降低氧化應激產物MDA和

16、蛋白質羰基含量,下調MnSOD和CuZnSOD的表達。減少炎癥因子的分泌,抑制MAPK通路的激活。而IPCs不能抑制MAPK通路,對氧化應激及炎癥反應沒有明顯改善。
   結論:
   1.采用Ⅰ型膠原酶消化法成功培養(yǎng)ADSCs,穩(wěn)定增殖,表達間充質干細胞相關的表面抗原,具有成骨、成軟骨和成脂肪的多向分化潛能。
   2.尼克酰胺、活化素A和GLP-1能成功誘導ADSCs分化為有功能的IPCs。
   3

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