APC-Cdh1在機(jī)械拉伸損傷后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著現(xiàn)代交通和建筑工業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的發(fā)病率逐年增加，并成為青年人致殘的主要原因之一。目前脊髓損傷與修復(fù)的機(jī)制還不清楚，臨床上診療效果不能滿足需求。少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)唯一形成髓鞘的細(xì)胞，其與神經(jīng)元一樣對損傷刺激非常敏感。近年來研究認(rèn)為，脊髓損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致幸存軸突脫髓鞘，是影響神經(jīng)元軸突再生、修復(fù)的病理生理基礎(chǔ)。因此，研究如何有效抑制凋亡以及

2、促進(jìn)損傷后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）增殖活化是減輕脊髓損傷的一個重要環(huán)節(jié)。
　　研究顯示，細(xì)胞周期末期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase promotingcomplex，APC）及其調(diào)節(jié)亞基Cdh1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育及損傷修復(fù)中具有重要的作用。最近的研究已證實(shí)Cdh1參與缺血性腦損傷后神經(jīng)元凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖的病理生理過程，但APC-Cdh1在脊髓損傷后

3、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活化中的作用，尚不清楚。
　　本研究擬培養(yǎng)大鼠原代OPCs并建立體外細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型，探究機(jī)械損傷后OPCs增殖活化是否與APC-Cdh1活性有關(guān)。其次，利用腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，探討下調(diào)Cdh1對損傷后OPCs增殖活性的影響。最后，通過對干預(yù)前后Cdh1下游底物Id2和skp2的研究，探索Cdh1調(diào)控機(jī)械損傷后OPCs增殖活化的可能機(jī)制。本實(shí)驗從細(xì)胞周期調(diào)控的角度出發(fā)，旨在研究APC-Cdh1在機(jī)械

4、損傷后脊髓少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活化中的作用及機(jī)制，從而為選擇APC-Cdh1作為脊髓保護(hù)新靶點(diǎn)提供實(shí)驗依據(jù)。
　　第一部分大鼠脊髓源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞體外機(jī)械拉伸損傷模型的建立與評價
　　目的：
　　利用FX-4000T?柔性基底加載系統(tǒng)建立體外大鼠脊髓源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型。
　　方法：
　　取新生48h內(nèi)SD乳鼠脊髓，在原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上利用改良的振搖法獲得純化的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞

5、，并采用其特異性標(biāo)志物A2B5進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞鑒定。利用FX-4000T?柔性基底加載系統(tǒng)建立少突膠質(zhì)前體細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型，將純化培養(yǎng)3d的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞隨機(jī)分為A組（對照組）、B組（拉伸幅度5％）、C組（拉伸幅度10%）、D組（拉伸幅度15%），拉伸2h后于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)；MTT法檢測細(xì)胞存活率；雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　體外成功培育少突膠質(zhì)前體細(xì)胞且A2B5陽性細(xì)胞約占90%。

6、B組拉伸幅度對細(xì)胞形態(tài)及存活沒有明顯影響，基本不構(gòu)成損傷。C組和D組細(xì)胞存活率較A組顯著降低（P<0.05），凋亡率也明顯升高（P<0.05），并出現(xiàn)明顯病理性形態(tài)改變；但D組有明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象且細(xì)胞存活率降到50%以下，不利于后續(xù)實(shí)驗進(jìn)行。
　　結(jié)論：
　　改良的振搖法是體外培養(yǎng)大鼠脊髓少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的可靠方法，利用FX-4000T?柔性基底加載系統(tǒng)以10%為拉伸強(qiáng)度可建立少突膠質(zhì)前體細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型。
　　

7、第二部分 APC-Cdh1在機(jī)械拉伸損傷后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活化中的作用及機(jī)制
　　目的：
　　探討APC-Cdh1在機(jī)械拉伸損傷后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖活化中的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　將體外純化培養(yǎng)3d的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞隨機(jī)分組。前期實(shí)驗分為4組，分別為正常對照組（未進(jìn)行拉伸），Stretch-2h組（拉伸2h），Stretch-6h組（拉伸6h），Stretch-12h組（拉伸12h）；后期實(shí)驗

8、加入RNA干擾因素，分為4組，分別為正常對照組（未進(jìn)行腺病毒感染和拉伸），Stretch組（未進(jìn)行腺病毒感染但拉伸12h），Ad-Control-Stretch組（空載體腺病毒感染后拉伸12h），Ad-Cdh1-Stretch組（Cdh1-shRNA腺病毒感染后拉伸12h）。所有組別均于拉伸后繼續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)48h收集細(xì)胞。采用 MTT比色法和流式細(xì)胞術(shù)周期分析綜合測定細(xì)胞增殖情況；采用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測Cdh

9、1及其下游底物Skp2和Id2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.機(jī)械拉伸2h即可發(fā)現(xiàn)增殖活性開始降低并且隨著拉伸時間的延長而不斷下降，以Stretch-12h組下降最為明顯；Western blot結(jié)果顯示：Stretch-2h組、Stretch-6h組、Stretch-12h組Cdh1蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組，且表達(dá)具有時間遞增趨勢，尤以Stretch-12h組上調(diào)最為明顯（P<0.05）。
　　

10、2.RNA干擾后，Ad-Cdh1-Stretch組Cdh1蛋白表達(dá)明顯低于Ad-Control-Stretch組（P<0.05）；而Ad-Cdh1-Stretch組細(xì)胞增殖活性顯著高于Ad-Control-Stretch組（P<0.05）。
　　3.Cdh1的下游底物Skp2和Id2表達(dá)隨著Cdh1人為干預(yù)的變化而變化，且趨勢與Cdh1相反：Skp2和Id2在細(xì)胞機(jī)械損傷后被下調(diào)，而腺病毒介導(dǎo)的Cdh1 RNA干擾能上調(diào)損傷后Sk