神經母細胞瘤B104細胞株條件培養(yǎng)基促進少突膠質前體細胞增殖的機制研究.pdf

1、目的：鑒定介導神經母細胞瘤 B104細胞株條件培養(yǎng)液(B104 neuroblatoma cells conditioned medium, B104CM)中誘導少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)增殖的關鍵因子，并探討B(tài)104CM誘導OPCs增殖的信號轉導機制。
　　方法：（1）培養(yǎng)B104神經母細胞瘤細胞株，離心過濾收集條件培養(yǎng)液。（2）手術分離取出 E16天 SD大鼠

2、胎鼠的脊髓，消化分離細胞，以免疫粘附法得到純化的OPCs，進行原代培養(yǎng)。（3）用免疫熒光染色法標記OPCs特異性標志物鑒定OPCs。（4）將不同濃度的B104CM(0，10％，30%，50%，100%)加入到無生長因子的少突膠質前體細胞培養(yǎng)物中，以BrdU摻入染色法結合A2B5染色鑒定OPCs的增殖。（5）以逆轉錄RT-PCR檢測PDGF-AA、bFGF和IGF-1 mRNA在B104細胞的表達，以酶聯免疫吸附測定（enzyme lin

3、ked immunosorbent assay,ELISA）檢測B104CM中 PDGF-AA、bFGF和 IGF-1的蛋白含量，通過免疫熒光染色來驗證 PDGFR、FGFR2和IGFR在OPCs上的表達，篩選出可能促進OPCs增殖的候選生長因子。（6）應用生長因子受體的特異性抑制劑觀察B104CM中候選生長因子對OPCs增殖的影響，最終鑒定出B104CM中影響OPCs增殖的關鍵因子。（7）蛋白質印跡法(Western Blot)檢測E

4、rk1/2、PI3K、p38和JNK在B104CM誘導OPCs增殖中的活化（磷酸化）。（8）RT-PCR和Real-time-PCR法檢測B104CM誘導OPCs增殖過程中可能涉及的立早基因和細胞周期蛋白的表達變化。
　　結果：（1）成功分離、培養(yǎng)出OPCs，其純度高達95%以上。（2）BrdU摻入法結合A2B5染色證實B104CM可誘導OPCs的增殖。（3）RT-PCR結果證明B104細胞表達PDGF-AA、bFGF和IGF-1

5、 mRNA，ELISA檢測到PDGF-AA、bFGF和IGF-1三種生長因子在無濃縮的B104CM中的濃度分別達到23.42±4.28、12.94±3.05和7.21±2.12 ng/ml；免疫熒光染色發(fā)現 OPCs表達 PDGFR、FGFR和 IGFR。（4） PDGFR、FGFR信號的抑制劑AG1295和PD173074顯著降低B104CM誘導的OPCs增殖，但IGFR的抑制劑無明顯影響。（5）Western Blot結果證明，B1

6、04CM誘導OPCs內Erk1/2和JNK的活化（磷酸化）；Erk1/2的抑制劑U0126和JNK的抑制劑 SP600125均可顯著降低 B104CM誘導 OPCs增殖。（6）RT-PCR結果證明， B104CM可刺激立早基因c-fos、c-jun、Id-2和細胞周期蛋白cyclin D1、D2、E表達的增加，且Erk抑制劑可抑制其表達。（7）B104CM刺激立早基因c-jun，c-fos， c-myc表達的增加，但降低SMAD4和AT

7、F-2的表達，且JNK抑制劑可分別抑制和恢復其表達。
　　結論：1. PDGF-AA和bFGF是介導B104CM誘導OPCs增殖的關鍵因子。2. Erk1/2信號通路的激活是B104CM誘導OPCs增殖的關鍵分子事件，B104CM激活Erk1/2信號通路，并啟動下游立早基因c-jun，c-fos，Id-2和細胞周期蛋白cyclin D1，cyclin D2和cyclin E等轉錄因子的表達，啟動OPCs的增殖。3. JNK信號通路