肌相關(guān)micro RNAs在維甲酸誘導(dǎo)舌發(fā)育異常中對舌肌分化調(diào)控的機制研究.pdf

1、背景:腭裂是口腔頜面部常見的先天畸形之一，是通過基因與環(huán)境因素交互作用造成的多基因易感性疾病。在本課題組前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)維甲酸(retinoic acid,RA)誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂發(fā)生同時常伴有舌發(fā)育的畸形。發(fā)生腭裂的小鼠舌體在胚胎第14.5天并未下降，仍充滿口腔，使兩側(cè)腭突仍位于舌體的兩側(cè)，無法轉(zhuǎn)入水平生長期，進而無法在中線處融合。該時期腭裂胎鼠不僅舌體形態(tài)以及舌體中舌肌的纖維走形發(fā)生異常，而且其相關(guān)成肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic

2、Regulatory Factors，MRFs)的表達量也異于正常的胎鼠。舌肌是舌組織的主體，而舌肌屬于骨骼肌，因此，對骨骼肌發(fā)生發(fā)育起到調(diào)控作用的一系列基因也在舌肌的分化過程中起到一定的作用。肌相關(guān)microRNAs，即MyomiRs，就是一類在肌肉中富集的microRNAs，它們對成肌過程起到一定的調(diào)控作用。研究表明:在分化過程中，miR-206直接靶向結(jié)合Pax7，Pax7抑制相關(guān)MRFs的表達，miR-206抑制Pax7之后使得

3、MRFs表達上升，從而達到促進分化的作用;miR-1和miR-206有著高度相似的核苷酸序列，在骨骼肌的分化中也有著相似的作用。但是，關(guān)于MyomiRs在舌發(fā)育過程中，尤其是維甲酸誘導(dǎo)腭裂小鼠舌異常的發(fā)育過程中對于MRFs和Pax3/Pax7的相關(guān)調(diào)控作用，尚未見報道。
　　目的:通過檢測維甲酸誘導(dǎo)小鼠胚胎腭裂模型中胎鼠舌體發(fā)育過程中相關(guān)MyomiRs、MRFs以及Pax3/Pax7的表達變化，來探究MyomiRs在舌肌分化過程中

4、的調(diào)控作用，推測維甲酸致胎鼠腭裂伴發(fā)舌異常的可能機制，為腭裂機制的研究以及舌發(fā)育異常的機制提供相關(guān)理論依據(jù)。
　　方法:選取10周齡左右SPF級ICR孕鼠，在胚胎10天時按孕鼠體重100mg/kg灌胃維甲酸建立胎鼠腭裂動物模型。分別在E13.5、E14.5、E15.5和E18.5用頸部脫臼法處死孕鼠，在用DEPC水配置的PBS中取出并收集胚胎小鼠的舌體組織。利用異硫氰酸胍法（Trizol法）提取組織總RNA;用非特異性染料(SYB

5、R(@)GreenⅠ)實時定量PCR技術(shù)檢測舌體中相關(guān)成肌因子和盒轉(zhuǎn)錄因子的表達;用特異性染料（TaqMan探針）實時定量PCR技術(shù)檢測舌體中相關(guān)MyomiRs的表達。
　　結(jié)果:
　　1、小鼠胚胎發(fā)育過程中，miR-1和miR-206在小鼠胚胎舌體發(fā)育過程中的相對表達量均持續(xù)上升，且表達均在出生前，即E18.5達到最高峰。
　　2、RA誘導(dǎo)小鼠腭裂組的小鼠舌體中miR-1及miR-206的表達變化趨勢與正常組相似，但

6、相對表達量在舌體發(fā)育各個階段均低于正常組，miR-1的結(jié)果在E14.5和E15.5具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);miR-206的結(jié)果在E13.5具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3、胚胎發(fā)育過程中，正常組和RA誘導(dǎo)小鼠腭裂組的小鼠舌體中MyoD和Myf5的相對表達量都在E14.5達到峰值，隨后下降。在E13.5和E14.5，腭裂組MyoD的表達均低于正常組，且在E14.5的結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);而在E15.5，腭

7、裂組MyoD的表達卻高于正常組，且結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。在E14.5和E15.5，腭裂組Myf5的相對表達量均低于正常組，且在E15.5的結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4、胚胎發(fā)育過程中，正常組和RA誘導(dǎo)小鼠腭裂組的小鼠舌體中Pax3的表達均在E14.5達到峰值，而Pax7的表達均在E15.5達到峰值。腭裂組舌體中Pax3的相對表達量在E14.5顯著高于正常組(p＜0.05);而腭裂組Pax7的相對表達量則在