BMP-2-Smad調(diào)控PMVECs肌樣分化在HPS肺微血管異常擴(kuò)張中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是一種慢性肝病的晚期并發(fā)癥，主要臨床癥狀為難治性低氧血癥。據(jù)臨床資料統(tǒng)計(jì)，肝肺綜合征在肝硬化患者中發(fā)病率為4-29％。目前，HPS的發(fā)病機(jī)制研究已取得一定的成果，但仍然未完全闡明，且臨床轉(zhuǎn)化治療還需進(jìn)一步開展。其中，血管異常擴(kuò)張、動(dòng)靜脈分流、氧合功能障礙是HPS的主要病理表現(xiàn)，這些變化通常引起肺血管重建，從而加速肺部病理的惡化進(jìn)程。肺微血管異常

2、擴(kuò)張的病理機(jī)制是HPS中的研究熱點(diǎn)，在我們團(tuán)隊(duì)的前期研究中發(fā)現(xiàn)，血管的異常擴(kuò)張可能與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)的異常增殖有關(guān)，而在另一方面，我們發(fā)現(xiàn)HPS病人在進(jìn)行肝移植手術(shù)后，肺微血管阻力明顯升高，表明肺微血管存在收縮反應(yīng)，而在正常情況下，肺微血管是不具備這一特性的，血管的異常擴(kuò)張無法完全用PMVECs的異常增殖來進(jìn)行解釋，因此可能存在其他的病理

3、機(jī)制。在前期實(shí)驗(yàn)，采用HPS大鼠血清對(duì)PMVECs進(jìn)行刺激培養(yǎng)，隨后發(fā)現(xiàn)PMVECs中肌性相關(guān)蛋白SM-α-actin、calponin、SM-MHC的表達(dá)水平顯著上調(diào)，這些結(jié)果提示PMVECs在HPS血清病理?xiàng)l件下發(fā)生了肌樣分化，因此具有收縮特性。在先前的研究報(bào)道中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenic protein-2，BMP-2)在細(xì)胞的增殖、分化及遷移中起重要調(diào)節(jié)作用，但是其在PMVECs肌樣分化中的作用還不太明

4、確。因此本研究擬證實(shí)HPS血清通過上調(diào)BMP-2/Smad信號(hào)通路引起PMVECs發(fā)生肌樣分化。
　　方法：
　　1.構(gòu)建HPS大鼠模型并制備血清，培養(yǎng)大鼠原代PMVECs;檢測(cè)HPS大鼠血清對(duì)PMVECs肌樣分化的影響
　　本課題的HPS大鼠模型采用膽總管結(jié)扎法(chronic bile duct ligation，CBDL)進(jìn)行構(gòu)建，模型構(gòu)建28天之后，采集動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?，隨后取肺組織和肝組織進(jìn)行HE染色，最后

5、收集并制備正常血清和HPS血清備用。采用組織塊法培養(yǎng)原代PMVECs，組織化學(xué)法進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原鑒定。將第3代PMVECs在含5％HPS血清的內(nèi)皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)0h、24h、48h和72h后，觀察PMVECs形態(tài)的變化情況，同時(shí)檢測(cè)肌性相關(guān)蛋白SM-a-actin，caplonin，SM-MHC的表達(dá)變化。
　　2.檢測(cè)HPS大鼠血清對(duì)PMVECs中BMP-2/Smad信號(hào)通路的影響
　　將PMVECs分為正常血清組（C

6、組）和HPS血清組(HPS組)，分別采用含5％正常血清或5％HPS血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PMVECs24h、48h和72h，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后采用RT-PCR和western blot檢測(cè)各組PMVECs中BMP-2轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)采用western blot檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)PMVECs中BMP-2下游關(guān)鍵蛋白Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平。
　　3.檢測(cè)人重組蛋白Noggin對(duì)HPS血清介導(dǎo)PMVECs肌樣

7、分化的影響。
　　采用BMP-2抑制劑人重組蛋白Noggin預(yù)處理，檢測(cè)在不同血清刺激培養(yǎng)72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的變化。并檢測(cè)肌性相關(guān)蛋白SM-a-actin，caplonin，SM-MHC表達(dá)的變化。
　　4.檢測(cè)Smurf-1依耐性Smad1/5蛋白降解對(duì)HPS血清調(diào)控PMVECs中BMP-2/Smad通路活性的影響
　　將PMVECs分為正常血清組（C組）和HPS血清組

8、(HPS組)，分別采用含5％正常血清或5％HPS血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PMVECs24h、48h和72h，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后采用western blot檢測(cè)各組PMVECs中Smurf-1蛋白表達(dá)變化。之后，采用siRNA下調(diào)PMVECs中Smurf-1的表達(dá)水平，分別檢測(cè)不同血清刺激培養(yǎng)72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的變化。并進(jìn)一步采用蛋白酶體抑制劑MG132處理PMVECs后，分別檢測(cè)在不同血清刺激培

9、養(yǎng)72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.HPS大鼠血清促進(jìn)PMVECs的肌樣分化
　　在倒置顯微鏡下觀察:C組培養(yǎng)PMVECs多呈現(xiàn)為梭形。而HPS組培養(yǎng)PMVECs多呈現(xiàn)為呈長(zhǎng)梭形，與C組形態(tài)相差巨大。在HPS血清刺激之前，PMVECs內(nèi)未檢測(cè)SM-α-actin、calponin、SM-MHC等蛋白表達(dá)，而HPS血清刺激24h、48h、72h后，PMVECs

10、內(nèi)SM-α-actin、calponin、SM-MHC蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，呈時(shí)間依耐性。
　　2.HPS大鼠血清激活PMVECs中BMP-2/Smad信號(hào)通路
　　相比C組，HPS組PMVECs內(nèi)BMP-2mRNA及其蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，呈時(shí)間依耐性;同時(shí)，BMP-2下游關(guān)鍵分子Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平顯著增加(P＜0.05)，呈時(shí)間依耐性;
　　3.人重組蛋白Noggin部分

11、抑制HPS血清介導(dǎo)PMVECs肌樣分化的進(jìn)程
　　人重組蛋白Noggin能顯著抑制HPS血清介導(dǎo)BMP-2/Smad信號(hào)通路的活化，并抑制PMVECs中肌性蛋白SM-α-actin、calponin的表達(dá)(P＜0.05)，但對(duì)SM-MHC的表達(dá)沒有影響(P＞0.05)。
　　4.HPS血清抑制Smurf-1介導(dǎo)的Smad1/5降解，促進(jìn)BMP-2/Smad信號(hào)通路的過度激活
　　相比C組中各時(shí)間點(diǎn)，HPS組PMVECs

12、內(nèi)Smurf-1蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，呈時(shí)間依耐性;在HPS血清刺激下，siRNA-Smurf-1和MG132能進(jìn)一步抑制PMVECs內(nèi)Smad1/5的降解，促進(jìn)BMP-2/Smad的活化。
　　結(jié)論：
　　本研究表明HPS大鼠血清誘導(dǎo)的PMVECs內(nèi)BMP-2及其mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而其下游的Smad1/5異常激活與HPS血清誘導(dǎo)的Smurf-1下調(diào)有關(guān)。采用人重組蛋白Noggin抑制BMP-2/Smad的活化，