維甲酸誘導基因-Ⅰ對髓系造血的調控及分子機制研究.pdf

1、急性早幼粒細胞性白血病(APL)，是第一個用生理性的小分子一一全反式維甲酸誘導分化的白血病。通過分子細胞遺傳學分析發(fā)現(xiàn)所有APL中由染色體易位造成的融合蛋白都保留了維甲酸受體α(RARα)羧基端的大部分。而這種由RARα組成的融合蛋白(x-RARα)降低了對ATRA的反應性，使得它不能被可以激活野生型RARα的生理濃度ATRA活化，只有在藥理劑量的ATRA作用下才能激活并釋放共抑制物、募集共激活物，使下游基因開放表達。但是這些開放的基因

2、是什么，它們如何影響細胞分化等相關問題有待進一步研究。 我們通過研究APL細胞株NB4在ATRA誘導分化時的mRNA表達譜發(fā)現(xiàn)了一批基因，其中Rig-I(維甲酸誘導基因I)可以被ATRA明顯上調。進一步研究發(fā)現(xiàn)Rig-ImRNA和蛋白質水平均在3-6小時明顯上調，并且Rig-I上調和NB4細胞的分化高度一致。在ATRA耐藥細胞株NB4-R2中沒有Rig-I的上調。提示Rig-I是粒系分化的關鍵。 為了證實Rig-I對粒細

3、胞發(fā)育的重要性，我們敲除了小鼠Rig-I基因組的第4-8外顯子。早在8-12周齡的Rig-I<'-/->小鼠就可以表現(xiàn)出明顯的造血異常。在大體解剖上表現(xiàn)為脾臟輕到中度增大。骨髓和外周血細胞總數(shù)并沒有明顯改變。然而，通過流式細胞術分析造血細胞各系發(fā)現(xiàn)粒細胞明顯增生。骨髓和脾臟中都可以看到造血干細胞(Lin<'->，Sca-1<'+>，c-Kit<'+>)、髓系祖細胞(Gr-1<'low>，c-Kit<'+>)近倍增加。而Mac-1<'++

4、>，Gr-1<'++>的后期粒細胞明顯增加，同時Mac-1、Gr-1的表達強度略低于野生型小鼠，提示粒細胞的增生和一定程度的成熟障礙。與粒細胞相反，B細胞表現(xiàn)為生成減少和后期成熟明顯被阻滯。碘化丙錠(PI)和AnnexinV染色顯示Rig-I缺陷小鼠粒細胞同時有凋亡減少和增殖增加。外周血、骨髓和脾臟造血細胞形態(tài)學改變和流式細胞術檢查結果一致，都為環(huán)狀核粒細胞為主，并表現(xiàn)為部分的成熟障礙。體外半固體培養(yǎng)顯示，Rig-I缺陷小鼠對G-CSF

5、的反應性降低，集落細胞的流式細胞分析顯示(Gr-1<'low>，c-Kit<'+>)比例增加，也提示粒細胞的分化受阻。相反，通過逆病毒載體在造血細胞過表達Rig-I后，表達Rig-I的細胞很快減少。 Rig-I缺陷小鼠在髓系造血上的變化很像融合基因PML／RARα和PLZF／RAR α轉基因小鼠完全發(fā)病前的造血改變，這提醒我們檢查了x-RARα轉基因小鼠磁珠分離的c-Kit、B220-、Terll 9、cD3細胞的的Rig-I表

6、達情況，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平明顯降低。而且完全發(fā)病時轉基因小鼠的CD34’細胞也有Rig-I的表達減少。我們通過熒光素報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)IRFl對Rig-I有轉錄激活作用，在預測的IRFl結合位點的單堿基突變即可破壞Rig-I的啟動子活性。有趣的是，在IRF-l信號傳遞的下游就是TRAIL，它在ATRA誘導的APL細胞凋亡和IFN調節(jié)機制中具有重要作用。我們的數(shù)據(jù)顯示在Rig-I缺陷鼠和PML／RARα、PLzF／RARα轉基因小鼠的造血細胞或

7、白細胞細胞中IRFl和TRAIL的表達均明顯減少。這些都提示在APL細胞中融合蛋白XRARα可以通過影響IRFl下調TRAIL并使細胞獲得額外得生存優(yōu)勢從而導致發(fā)病。其中Rig-I的下調也起到了一定作用，因為我們發(fā)現(xiàn)Rig-I可以顯著增強IRFl、TRAIL和IFN β的啟動子活性。此外，我們發(fā)現(xiàn)PIAsl、PML表達減少，而PIMl、STATl表達增加，它們在造血調控和白血病發(fā)病中有重要作用。但是，Rig-I是如何引起這些改變的，Ri