多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、第一部分犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)性質(zhì)的研究
　　目的：探討犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、純化、擴增的方法，證實其自我更新能力及多向分化潛能，為細(xì)胞移植治療急性心肌梗死(AMI)做準(zhǔn)備。
　　方法：無菌條件下用骨髓穿刺針獲取骨髓液，用密度為1.073 g/ml的Percoll分離液通過密度梯度離心法獲取骨髓單個核細(xì)胞，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液種植細(xì)胞，通過貼壁篩選法獲得純化的MSCs。

2、細(xì)胞生長融合達(dá)80％左右時，用胰酶消化傳代細(xì)胞，細(xì)胞消化、傳代培養(yǎng)三代后，可獲得大量的純度較高的MSCs。對不同代MSCs進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并繪制生長曲線，觀察細(xì)胞生長特性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對MSCs表面標(biāo)記蛋白CD29、CD34進(jìn)行表面抗原鑒定。取第3代MSCs分別進(jìn)行成骨組織以及脂肪組織的誘導(dǎo)分化，通過茜素紅以及油紅O染色檢測是否誘導(dǎo)分化為成骨組織以及脂肪組織。
　　結(jié)果：采用密度梯度法獲得犬骨髓單個核細(xì)胞，剛分離的細(xì)胞體積較小，呈

3、圓形。細(xì)胞培養(yǎng)72小時后觀察可見單個或少量成集落樣生長的貼壁細(xì)胞克隆，形態(tài)大多呈短梭形，原代細(xì)胞培養(yǎng)10-12天達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞傳代后增殖較快，MSCs生長曲線繪制顯示，MSCs生長曲線呈S型，第6-7天生長達(dá)到高峰。流式細(xì)胞檢測顯示犬MSCs CD29呈陽性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)。多向分化能力檢測顯示，在不同誘導(dǎo)環(huán)境下MSCs可向成骨組織以及脂肪組織分化。
　　結(jié)論：犬MSCs取材方便，通過密度梯度離心法可獲得單核細(xì)胞。利用

4、貼壁篩選法在體外培養(yǎng)、擴增可在短期內(nèi)獲得大量純化的、性質(zhì)穩(wěn)定的MSCs。傳代后MSCs生長迅速，在不同的誘導(dǎo)環(huán)境下可以向成骨組織以及脂肪組織分化，證實其具有多向分化能力，可為體外移植治療急性心肌梗死提供豐富的細(xì)胞來源。
　　第二部分多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死的實驗研究
　　第一節(jié)多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對犬梗死心肌血管新生的影響
　　目的：探討多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(

5、MSCs)治療急性心肌梗死(AMI)的可行性及對缺血心肌血管新生的影響。
　　方法：通過結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支的方法建立AMI模型，AMI模型建立一周后，將存活的犬隨機分成細(xì)胞移植組和PBS對照組。分離頸動脈，在超聲心動圖的引導(dǎo)下，沿頸動脈將多功能導(dǎo)管逆主動脈送入左心室。在心腔內(nèi)超聲圖像下，識別左室前壁心肌搏動較弱區(qū)域或搏動不規(guī)則區(qū)域，在心腔內(nèi)超聲監(jiān)控下，通過鎳鈦合金注射針將體外培養(yǎng)、擴增的MSCs注射到梗死中心區(qū)以及梗死邊界區(qū)，

6、每個點注射0.2ml，每只犬注射5個點，對照組注射相同劑量的PBS液。完成注射后，動物繼續(xù)飼養(yǎng)4周，處死動物，取心肌組織作冰凍切片和石蠟切片。通過冰凍切片觀察移植細(xì)胞存活情況，采用HE染色以及vWF免疫組化染色觀察心肌梗死區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化以及血管新生情況。
　　結(jié)果：所有動物均成活到實驗結(jié)束，無動物死亡。鎳鈦合金注射針插入心肌內(nèi)注射時，可發(fā)現(xiàn)室性早搏，但無惡性心律失常發(fā)生。整個實驗過程中動物生命體征平穩(wěn)，無心跳驟停、室性心動過速、血

7、栓形成等嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。在所有動物中，多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管顯示靶向心肌解剖結(jié)構(gòu)，能夠?qū)崟r觀察到注射針在心肌內(nèi)的位置，能夠區(qū)分低回聲信號的心腔、心肌以及高回聲信號的注射針。組織冰凍切片顯示，靶向移植心肌有移植細(xì)胞存活。HE染色顯示對照組心肌梗死區(qū)心肌組織炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞消失，纖維瘢痕組織增生顯著。細(xì)胞移植組心肌細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤較少，纖維瘢痕組織增生較少。光學(xué)顯微鏡下觀察，VWF染色微血管為棕黃色，細(xì)胞移植組新生血管數(shù)量較多，對

8、照組血管數(shù)量較少，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管經(jīng)心內(nèi)膜移植MSCs治療AMI安全、可行，可以將MSCs遞送到靶向心肌，MSCs可以促進(jìn)缺血心肌血管管再生。
　　第二節(jié)多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對犬心室重構(gòu)的影響
　　目的：探討多功能心腔內(nèi)導(dǎo)管移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療急性心肌梗死(AMI)對缺血心肌心室重構(gòu)的影響。
　　方法：通過結(jié)扎犬冠狀動脈左前降支的方法建立AMI

9、模型，AMI建模前、建模后1周以及細(xì)胞移植4周后分別對動物進(jìn)行心功能進(jìn)行檢測。獲取二維超聲心動圖，于左心室乳頭肌水平描記M型超聲，分析心臟功能，測得左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。同時獲得心尖2腔或4腔切面，使用雙平面Simpson法驗證，取三個心動周期測量的平均值。細(xì)胞移植4周后，將測量導(dǎo)管緩慢送入左心室，連接生理通道記錄儀，描記心率、左心室收縮末壓力、左心室舒張末壓力，并計算左心室壓力最大上升和下降速率。動物取材后，稱取心臟總質(zhì)量，計算心

10、臟質(zhì)量指數(shù)。標(biāo)本石蠟包埋后進(jìn)行VG染色，顯微鏡下觀察染色情況并獲取圖片，測量左室截面積和纖維瘢痕面積，計算梗死面積。
　　結(jié)果：超聲心動圖顯示，動物建模前，細(xì)胞移植組和對照組左心室射血分?jǐn)?shù)LVEF相似。動物建模1周后，細(xì)胞移植組和對照組LVEF相似，都出現(xiàn)明顯的降低。細(xì)胞移植4周后，細(xì)胞移植組LVEF有所增加，對照組LVEF減少，與對照組相比較，細(xì)胞移植組平均LVEF有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。血流動力學(xué)檢測顯示，細(xì)胞移植組血流