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文檔簡介
1、目的: 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為心肌是終末分化組織,梗死后由瘢痕組織修復(fù),為保持心臟的泵血功能,進(jìn)而發(fā)生退行性左室重塑,心功能下降,最終會導(dǎo)致心力衰竭。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)擁有多向分化的潛能,在心臟的微環(huán)境中可以分化為心肌樣細(xì)胞并表現(xiàn)其功能表現(xiàn)型,利用其移植替代壞死心肌阻止心臟衰竭的惡化進(jìn)程甚至修復(fù)受損心肌已成為目前心肌梗死治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生長因子在細(xì)胞的移行,存活以及分
2、化中具有重要作用,局部微環(huán)境中應(yīng)用生長因子可以提高移植細(xì)胞的存活和功能,然而其效果并未得到明確證實(shí)。因此本研究在BMSCs與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growthfaCtor-1,IGF-1),運(yùn)用激光捕獲分化的間充質(zhì)干細(xì)胞,通過檢測其心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的表達(dá)研究生長因子在干細(xì)胞分化過程中的重要作用。同時(shí)通過聯(lián)
3、合干細(xì)胞移植觀察其對于梗死后心肌的細(xì)胞治療作用。 方法: 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng) 取健康成年兔(5個(gè)月左右,體重2.0-2.5kg,中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心),于無菌條件下抽取兔股骨骨髓2-3mL,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。2天后BMSCs黏附于培養(yǎng)瓶底,血細(xì)胞等懸浮于培養(yǎng)液中,每3~4d換液一次,4次后非貼壁細(xì)胞全部棄凈。心肌細(xì)胞取自新生兔(1-3天)心室,采用胰酶連續(xù)消化法分離細(xì)胞后
4、,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以后每2d換液1次。BMSCs與心肌細(xì)胞按1:1比例混合進(jìn)行共同培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組加入150 ng/ml HGF和200 ng/ml IGF-1,對照組不加。 2、心肌梗死模型的建立及細(xì)胞移植 取28只健康成年兔(中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心),體重2.0-2.5kg,隨機(jī)分為4組,每組7只,分別為:聯(lián)合應(yīng)用治療組,單純干細(xì)胞治療組,生長因子治療組,安慰劑組為對照組。3%戊巴比妥鈉(3
5、0 mg/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉,于胸骨左緣Ⅲ,Ⅳ肋間開胸,充分暴露心臟。用眼科小圓針(5-0線)在冠狀動脈左室支主干第1,2對角支之間閉塞血管1小時(shí)后再灌注。心電圖Ⅱ?qū)?lián)上出現(xiàn)S-T段弓背樣抬高標(biāo)志建立缺血再灌注心肌梗死模型成功。MI術(shù)后3天,再次按原切口打開胸腔,暴露心臟,選取心肌瘢痕周邊及中央共4個(gè)注射點(diǎn),以微量注射器(10 ul)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及生長因子。聯(lián)合應(yīng)用治療組(MSCs+GF)nl=7,給予MSC和生長因子HGF,
6、IGF-1:混有MSCs 40ul(5x105/10ul),8ul DMEM(150ng/mlHGF、200ng/ml IGF-1)。單純干細(xì)胞治療組(MSCs)n2=7:單獨(dú)給予MSC(MSCs40ul)。生長因子治療組(GF)n3=7,單獨(dú)給予生長因子HGF,IGF-1:8ul DMEM(150ng/ml HGF、200ng/ml IGF-1)。對照組n4=7給予相同劑量DMEM培養(yǎng)液。 3、免疫化學(xué)染色 體外行細(xì)胞
7、共培養(yǎng)后,取培養(yǎng)后的細(xì)胞爬片,PBS清洗后,%4多聚甲醛固定30min,PBS洗5minx3,10%牛血清室溫封閉20min,吸出血清,加入兔抗-α-肌動蛋白單克隆抗體,PBS清洗后,二抗應(yīng)用山羊抗兔IgG抗體。經(jīng)DAB試劑盒顯色,蘇木素復(fù)染。細(xì)胞移植治療各組在心肌梗死后6周采集心臟標(biāo)本,行免疫熒光染色確定移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。一抗加入兔抗connexin 43單克隆抗體,4℃過夜。二抗應(yīng)用FITC(綠色熒光)—羊抗兔Ig
8、G抗體標(biāo)記結(jié)合。熒光顯微鏡下觀察DAPI+綠色激發(fā)光。 4、透射電鏡技術(shù) 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)緩沖液洗滌后于EP管內(nèi)固定,乙醇梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋,ULTRACUT E型超薄切片機(jī)切片,經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色后,Hitachi H-600-4透射電鏡觀察拍照。 5、激光顯微切割系統(tǒng)捕獲BMSCs BMSCs與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)1天,3天,1周,2周,直到6周。實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行肌纖維和核
9、的雙染色。兔抗-α-肌動蛋白單克隆體和山羊抗兔過氧化物酶結(jié)合的IgG抗體用來標(biāo)記肌纖維,蘇木素復(fù)染標(biāo)記細(xì)胞核。選取表達(dá)α肌動蛋白陽性并同時(shí)存在核分裂的細(xì)胞為由BMSCs分化來的心肌樣細(xì)胞,運(yùn)用激光顯微切割系統(tǒng)(Arcturus)進(jìn)行捕獲,每組捕獲大約500個(gè)細(xì)胞。 6、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 使用PicoPureRNA分離試劑盒對捕獲的干細(xì)胞提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。模板cDNA由Taq HS DNA多聚
10、酶(0.1μl)在含有兔GATA-4的上下游引物(0.2μl)中進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下:兔GATA-4,188bp,上游引物5’-GCCCCTCATcAAGCCTCAG-3’;下游引物5’-TCCCCTCTTTCCGCATCG-3’。Β-actin,315bp,上游引物5’-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3’;下游引物5’-GCCCGACTCGTCATACTCC-3、。PCR反應(yīng)體系45個(gè)循環(huán),每一個(gè)循環(huán)包括變性94℃40 s,
11、退火60℃40 s,延伸72℃60 s,45個(gè)循環(huán)后最后延伸72℃5min;以β-actin為內(nèi)參。凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的密度,計(jì)算產(chǎn)物的相對量。 7、時(shí)實(shí)三維測定心功能 采用PHILIP公司IE33型超聲儀,三維探頭X-3獲取左室三維容積圖像。運(yùn)用儀器自帶的QLAB分析軟件進(jìn)行圖象切割及分析。在干細(xì)胞移植及生長因子注射后6周對4組模型分別進(jìn)行三維測定。獲取左室收縮舒張末期容積參數(shù),測算每搏輸出量及射血分
12、數(shù)(EF)。 結(jié)論: 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)后可以分化成心肌樣細(xì)胞,并表達(dá)心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA-4。聯(lián)合應(yīng)用肝細(xì)胞生長因子和胰島素樣生長因子可以促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,提高GATA-4的表達(dá)。單純干細(xì)胞移植與聯(lián)合生長因子應(yīng)用都能有效改善心肌梗死后左室收縮功能,減輕室腔擴(kuò)大,提高心功能。然而聯(lián)合應(yīng)用生長因子較單純干細(xì)胞移植對于心肌梗死后心功能的恢復(fù)并未出現(xiàn)更好的治療的效果。提示生長因子對于干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化作用在
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