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文檔簡介
1、研究背景:
乙?;揎棡榧毎麅?nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種,可逆的乙?;揎椷^程可通過改變基因表達水平,蛋白酶活性以及蛋白蛋白相互作用調(diào)節(jié)細胞的各類活動。在線粒體內(nèi)總計1000-1500個蛋白中,大約有200多個蛋白存在乙?;揎椬饔茫渲卸鄶?shù)蛋白的乙?;揎椨蒒AD+依賴的去乙?;窼IRT3完成。SIRT3主要位于線粒體基質(zhì),線粒體內(nèi)有100多個蛋白的去乙?;cSIRT3相關(guān)。SIRT3表達的變化與線粒體內(nèi)ATP的生成,ROS水
2、平,蛋白的氧化損傷,以及呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ與Ⅱ的活性密切相關(guān)。SIRT3的異常低表達或缺失能夠?qū)е掳ò┌Y,衰老以及衰老相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生。研究已經(jīng)明確,SIRT3缺失或低表達能夠顯著提升細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平和蛋白質(zhì)氧化損傷。而細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的提高和蛋白質(zhì)氧化損傷的加劇同樣也是線粒體蛋白質(zhì)量控制低下的主要指標,并且與SIRT3異常相關(guān)的各類疾病同樣也發(fā)生于線粒體蛋白質(zhì)量控制缺陷的細胞中。雖然SIRT3相關(guān)的線粒體蛋白質(zhì)量控制的研究在過
3、去的2-3年內(nèi)已逐漸開展,而針對呼吸鏈復(fù)合體水平的蛋白質(zhì)量控制研究未見有任何報道。由于線粒體內(nèi)行使氧化磷酸化的蛋白均為復(fù)合體形式存在,直接對復(fù)合體水平而不是亞基水平的蛋白質(zhì)量控制機制進行研究將更有利于疾病發(fā)生機制的闡述。
研究目的:
1.明確SIRT3對線粒體功能的調(diào)控作用,其中包括線粒體ATP的生成,ROS生成,呼吸鏈復(fù)合體的酶活性;
2.通過體內(nèi)和體外實驗分析SIRT3與線粒體蛋白質(zhì)量控制的關(guān)系;
4、> 3.明確SIRT3通過何種途徑干預(yù)線粒體蛋白的質(zhì)量控制,為SIRT3相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的科學依據(jù)。
研究方法:
1.利用分子生物學手段建立SIRT3高表達細胞模型以及Sirt3基因敲除動物模型來研究SIRT3對線粒體生物學功能的改變作用;
2.利用非變性凝膠/免疫印跡技術(shù)以及呼吸鏈酶活性分析技術(shù)分析SIRT3與線粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白質(zhì)量的關(guān)系;
3.通過同位素示蹤以及免疫印跡技術(shù)研究S
5、IRT3對線粒體復(fù)合體質(zhì)量的影響;
4.利用免疫共沉淀技術(shù)尋找能夠調(diào)控線粒體復(fù)合體質(zhì)量且被SIRT3乙?;揎椀姆肿影閭H蛋白或蛋白酶;
5.利用免疫共沉淀/質(zhì)譜分析技術(shù)以及同位素免疫共沉淀技術(shù)研究分子伴侶調(diào)控線粒體復(fù)合體質(zhì)量控制的機制;
6.利用RNA干擾技術(shù)進一步確認SIRT3是否通過對特定靶蛋白的去乙?;揎椪{(diào)控呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量。
研究結(jié)果:
1.不管是長鏈SIRT3還是短鏈SIR
6、T3均能影響線粒體功能,結(jié)合以前的研究,我們發(fā)現(xiàn)SIRT3能夠通過其乙酰化作用影響呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的功能,復(fù)合體功能的改變也直接導致了線粒體ATP生成水平的改變。
2.SIRT3高表達能降低線粒體呼吸鏈復(fù)合體的含量,相應(yīng)的Sirt3基因敲除能夠提升復(fù)合體的含量,我們推測SIRT3可能通過影響復(fù)合體的組裝達到對呼吸鏈復(fù)合體含量的負調(diào)控作用,這種負調(diào)控作用在一定程度上增加了單位量復(fù)合體的酶活性。表明SIRT3與線粒體
7、呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量控制存在相關(guān)性。
3.SIRT3通過加快呼吸鏈復(fù)合體的更新速度(組裝與去組裝)來完成其對呼吸鏈復(fù)復(fù)合體的負調(diào)控作用。
4.作為蛋白質(zhì)量控制重要組成的GRP75功能受SIRT3調(diào)控,而SIRT3對呼吸鏈復(fù)合體質(zhì)量控制的調(diào)控作用可能經(jīng)由GRP75得以完成。
5.SIRT3介導的呼吸鏈復(fù)合體快速更新取決于較高水平的GRP75與呼吸鏈復(fù)合體的相互作用。GRP75的低表達能夠通過下調(diào)呼吸鏈復(fù)合體蛋白
8、的降解與組裝速度降低SIRT3過表達細胞中呼吸鏈復(fù)合體的更新速率。
6.GRP75是SIRT3介導的呼吸鏈復(fù)合體質(zhì)量控制的主要調(diào)控因子,高質(zhì)量的呼吸鏈復(fù)合體將進一步降低線粒體內(nèi)ROS的生成,從而維持更高質(zhì)量的呼吸鏈復(fù)合體蛋白。
結(jié)論:
SIRT3對GRP75蛋白的去乙?;揎椬饔媚軌蛟黾泳€粒體呼吸鏈復(fù)合體蛋白的更新,而這種快速更新可以通過對錯誤組裝以及損傷的呼吸鏈復(fù)合體高效清除能力來提高呼吸鏈復(fù)合體的質(zhì)量。
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