線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ功能抑制對大鼠皮層神經(jīng)元高壓激活鈣通道的作用及機制.pdf

1、線粒體是神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP的重要細胞器,ATP的合成依賴于線粒體中四個呼吸鏈復合體的電子傳遞作用。在缺氧情況下線粒體的功能受到了抑制,呼吸鏈的四個復合體的功能也受到了抑制,從而導致ATP合成減少和氧自由基的生成增加。這一系列變化尤其是氧自由基的生成增加會導致神經(jīng)元內(nèi)基因表達的變化,離子通道功能的變化,遞質(zhì)釋放的變化,細胞內(nèi)環(huán)境的變化等。在這些變化之中我們所關注的是線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ功能抑制后的鈣離子通道功能的變化。
　　

2、已有的研究表明在缺氧情況下線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ是產(chǎn)生氧自由基的主要部位,而且該復合體在缺氧情況下起到了氧感受器的作用,從而能夠調(diào)節(jié)細胞耐受缺氧的能力。這些都說明線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ在缺氧過程中起到了特殊的作用。我們實驗組前期的研究表明該復合體的功能抑制對于電壓門控鈉離子通道的功能會產(chǎn)生調(diào)控作用。由于電壓門控的鈉離子通道與神經(jīng)元的興奮性有關,因此該復合體對于鈉離子通道的調(diào)控作用就成為其調(diào)節(jié)細胞在缺氧過程中耐受缺氧能力的下游通路之一。

3、>　　但是更值得注意的是線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的功能抑制對于電壓門控的鈣離子通道是否也存在作用呢?這個問題具有更重要的意義,因為已有的大量研究表明鈣離子通道的功能直接影響了缺氧情況下神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度,而神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子濃度的變化與缺氧情況下神經(jīng)元的功能及其生存能力有著密切的聯(lián)系。因此揭示鈣離子通道的功能變化與線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ功能抑制之間的聯(lián)系以及這種聯(lián)系的內(nèi)在機制是非常有意義的。
　　本課題以線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ兩個活性中心

4、的特異性抑制劑Antimycin A和Myxothiazol作為工具藥來模擬缺氧情況下線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的功能抑制,并進而以全細胞膜片鉗技術(shù)來研究線粒體復合體Ⅲ的功能抑制對于電壓門控鈣離子通道的作用及其產(chǎn)生作用的內(nèi)在機制。實驗結(jié)果表明,線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的抑制劑AntimycinA對于電壓門控的鈣離子通道的功能存在抑制作用,而抑制劑Myxothiazol對于電壓門控的鈣離子通道的功能存在著增強作用。我們的研究還表明,過氧化氫的清除劑

5、和羥自由基的生成抑制劑能夠取消Amtimycin A對于鈣離子通道的抑制作用而超氧陰離子的清除劑能夠取消Myxothiazol對于鈣離子通道的增強作用。進一步的研究表明,廣譜的PKC抑制劑Chelerythrine能夠阻斷Antimycin A和Myxothiazol對于鈣離子通道的調(diào)控作用。對于Antimycin A作用機制的進一步研究表明,經(jīng)典型PKC抑制劑Ro318220能夠取消Antimycin A對于鈣電流的抑制作用;CGP

6、533534μM(PKCβ亞型的抑制劑)也能夠取消Antimycin A對于鈣電流的抑制作用,而CGP 533530.5μM(PKCβⅡ亞型的抑制劑)卻不能夠取消Antimycin A對于鈣電流的抑制作用。此外經(jīng)典型PKC激動劑Thymeleatoxin能夠模擬Antimycin A對于鈣電流的抑制作用。以上這些結(jié)果提示Antimycin A是通過H2O2-羥自由基-cPKC通路(主要是PKCβⅠ)來發(fā)揮對于鈣電流的抑制作用的。對于My

7、xothiazol的機制研究表明,PKCδ亞型的抑制劑能夠取消Myxothiazol對于鈣電流的增強作用。此外PKCδ亞型的激動劑也能夠模擬Myxothiazol對于鈣電流的增強作用。以上的這些結(jié)果表明Myxothiazol是通過超氧陰離子-nPKC通路(主要是PKCδ)來發(fā)揮對于鈣電流的增強作用的。
　　由于鈣超載被認為是造成缺氧后神經(jīng)元死亡的重要因素之一。而Antimycin A對于鈣電流存在抑制作用,從而減輕細胞內(nèi)的鈣超載。

8、因此Antimcyin A就有可能成為細胞缺氧后的一種保護機制。相反,Myxothiazol對于鈣電流存在增強作用,從而加重細胞內(nèi)的鈣超載,由此可能成為細胞缺氧后的一種損傷機制。為了考察這一假說,本課題又以氧糖剝脫(OGD)模型為細胞模型,以細胞存活率和LDH釋放量為指標考察了Antimycin A Myxothiazol對于缺氧情況下神經(jīng)元損傷的影響作用。結(jié)果顯示Antimycin A能夠減輕OGD對于神經(jīng)元的損傷作用,而Myxoth