JWA參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的堿基切除修復(fù)信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、氧化應(yīng)激(oxidative stress)是機(jī)體最常見的一類應(yīng)激反應(yīng)。在一些損傷因素的作用下，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝物增加，或細(xì)胞中抗氧化保護(hù)機(jī)制不足時(shí)，使活性氧產(chǎn)生堆積并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激或者氧自由基的產(chǎn)生已被認(rèn)為是DNA損傷的主要原因之一，可導(dǎo)致一系列的疾病包括癌癥和慢性血管性疾病。堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)是氧化應(yīng)激引起的主要的DNA損傷修復(fù)的形式之一，胞內(nèi)堆積的自由基攻擊D

2、NA造成損傷，從而引起了堿基切除修復(fù)信號(hào)通路的激活。 JWA(GenBank：AFO70523，1 998)是周建偉等從培養(yǎng)的原代人氣管和支氣管上皮細(xì)胞中分離并克隆的，受ATRA誘導(dǎo)的新的細(xì)胞骨架樣基因。本課題組多年來(lái)一直圍繞JWA基因的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系開展研究工作，取得了一系列原創(chuàng)性有意義的研究成果。先后證實(shí)JWA是一種新的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，不僅參與全反

3、式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)的細(xì)胞分化調(diào)節(jié)，而且與多種細(xì)胞分化、凋亡誘導(dǎo)劑(如TPA，4HPR和AS<,2>O<,3>等)的生物學(xué)作用有關(guān)，涉及相應(yīng)的信號(hào)通路，而且活躍地參與細(xì)胞對(duì)應(yīng)激刺激(如冷應(yīng)激和熱應(yīng)激)的應(yīng)答。近年來(lái)許多JWA的同源基因被報(bào)道發(fā)現(xiàn)。Ingley等發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)與JWA同源的基因ARL-6(AF133912)，兩者氨基酸序列同源性達(dá)93％，提示JWA與ARL-6可能有相似或相近的生物學(xué)功能，而該基因的作用主要涉及PARP與

4、DNA損傷和修復(fù)。本研究主要應(yīng)用氧化應(yīng)激模型、堿基切除修復(fù)模型和多種分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)探討JWA參與氧化應(yīng)激的機(jī)制，JWA參與堿基切除修復(fù)信號(hào)通途的調(diào)控規(guī)律，其與堿基切除修復(fù)蛋白之間的關(guān)系；初步明確JWA在細(xì)胞應(yīng)答氧化應(yīng)激中發(fā)揮的具體作用，構(gòu)建以JWA參與堿基切除修復(fù)過(guò)程為核心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；為最終闡明并完善細(xì)胞氧化應(yīng)激和堿基切除修復(fù)信號(hào)通路提供新的視角。 一、胞內(nèi)H<,2>O<,2>誘導(dǎo)JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激 選取經(jīng)典

5、的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑H<,2>O<,2>和B(a)P處理NIH-3T3和HELF細(xì)胞，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)JWA表達(dá)逐漸增加，有明顯的時(shí)間依賴效應(yīng)。為了探究何種氧自由基誘導(dǎo)了JWA的表達(dá)，我們將SOD(O<,2><'->·的拮抗劑)和過(guò)氧化氫酶catalase(胞內(nèi)H<,2>O<,2>的拮抗劑)應(yīng)用于H<,2>O<,2>和B(a)P誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型中，結(jié)果顯示在NHt-3T3細(xì)胞中用SOD處理后JWA表達(dá)無(wú)變化，而用catalase處理后原

6、本被H<,2>O<,2>和B(a)P誘導(dǎo)表達(dá)增加的JWA表達(dá)明顯下降，說(shuō)明胞內(nèi)H<,2>O<,2>誘導(dǎo)JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激。 二、核因子NFI調(diào)控JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激 構(gòu)建了JWA啟動(dòng)子區(qū)域的系列報(bào)告基因質(zhì)粒，利用報(bào)告基因試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)-107/+107的啟動(dòng)子區(qū)對(duì)氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)最為敏感。采用膠泳動(dòng)率遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)證實(shí)有核蛋白和-107/-28啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。為了進(jìn)一步揭示此核蛋白的身份，用Souchwestern實(shí)驗(yàn)證

7、實(shí)此核蛋白的分子量為47kD左右。最后用EMSA的超遷移實(shí)驗(yàn)(supershift)和RNA干涉實(shí)驗(yàn)證實(shí)該核蛋白是NFI。由于NFI的結(jié)合基序是CCAAT，而JWA-107/-28啟動(dòng)子區(qū)包含2個(gè)CCAAT反應(yīng)元件，為了確定NFI與JWA近端啟動(dòng)子區(qū)哪一個(gè)CCAAT結(jié)合，我們用Southwestern、EMSA、定點(diǎn)突變和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了核因子NFI與JWA近端啟動(dòng)子區(qū)的第二個(gè)CCAAT、結(jié)合從而調(diào)控JWA應(yīng)答氧化應(yīng)激。 三、

8、JWA保護(hù)氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的DNA單鏈損傷 成功構(gòu)建了JWA低表達(dá)的細(xì)胞株，采用堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種細(xì)胞對(duì)于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下的DNA損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在B(a)P誘導(dǎo)的過(guò)程中，JWA低表達(dá)的細(xì)胞較之對(duì)照細(xì)胞DNA損傷程度更加嚴(yán)重，并且修復(fù)的時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明JWA保護(hù)氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的DNA單鏈損傷。 四、JWA與堿基切除修復(fù)蛋白XRCCl和PARP1相互作用 由于JWA能夠保護(hù)氧化應(yīng)激引起的DNA損傷，我們推測(cè)JWA可能

9、是直接或間接參與了某個(gè)修復(fù)通路，而氧化應(yīng)激引起的主要的修復(fù)途徑是堿基切除修復(fù)，并且堿基切除修復(fù)通路中最重要的信號(hào)分子是XRCC1和PARP1。分別用H<,2>O<,2>和B(a)P處理質(zhì)粒對(duì)照NIH-3T3細(xì)胞和JWA缺陷型NIH-3T3細(xì)胞。在JWA蛋白表達(dá)正常的細(xì)胞中氧化應(yīng)激均能誘導(dǎo)JWA與XRCCl的表達(dá)增加，PARP1的表達(dá)明顯降低；而在JWA蛋白表達(dá)缺陷的細(xì)胞中，氧化應(yīng)激不能誘導(dǎo)XRCC1的表達(dá)變化，但是PARP1的表達(dá)明顯增

10、加。為了進(jìn)一步研究JWA與XRCCI在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的堿基切除修復(fù)中的關(guān)系，采用回復(fù)模型，即將JWA高表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到JWA低表達(dá)的細(xì)胞中，使得JWA的蛋白表達(dá)水平恢復(fù)正常，然后再用H<,2>O<,2>和B(a)P處理細(xì)胞，觀察JWA蛋白表達(dá)的變化對(duì)XRCC1和PARP1的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)采用JWAcDNApEGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染JWA缺陷型細(xì)胞，回復(fù)JWA蛋白的正常表達(dá)后，氧化應(yīng)激又能誘導(dǎo)JWA與XRCC1的表達(dá)增加，而PARP1的表達(dá)明顯

11、降低。之后，進(jìn)一步用免疫沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)了JWA與XRCC1在NIIt-3T3細(xì)胞中共定位。說(shuō)明在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路中，JWA與堿基切除修復(fù)蛋白XRCC1相互結(jié)合并且表達(dá)一致，而負(fù)調(diào)控PARP1的表達(dá)。 五、JWA在堿基切除修復(fù)信號(hào)通路中的定位 分別用H<,2>O<,2>和B(a)P處理質(zhì)粒對(duì)照NIH-3T3細(xì)胞和JWA缺陷型NIH-3T3細(xì)胞。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)識(shí)別蛋白APE1和縫合蛋白Lig Ⅲ的

12、表達(dá)。結(jié)果顯示，在JWA蛋白表達(dá)正常的細(xì)胞中氧化應(yīng)激均能誘導(dǎo)JWA與Lig Ⅲ的表達(dá)增加，而在JWA蛋白表達(dá)缺陷的細(xì)胞中，氧化應(yīng)激不能誘導(dǎo)Lig Ⅲ的表達(dá)變化；但是JWA對(duì)APE1的表達(dá)沒(méi)有任何的影響。說(shuō)明在氧化應(yīng)激過(guò)程JWA參與調(diào)控Lig Ⅲ(損傷位點(diǎn)修復(fù)縫合蛋白)而對(duì)APE1(損傷位點(diǎn)識(shí)別蛋白)無(wú)影響。進(jìn)一步說(shuō)明在堿基切除修復(fù)信號(hào)通路中JWA參與了損傷位點(diǎn)的修復(fù)和縫合過(guò)程而不參與損傷位點(diǎn)的識(shí)別過(guò)程。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在氧