孤獨癥模型大鼠經(jīng)典Wnt信號通路與氧化應激變化的研究.pdf

1、孤獨癥(autism)又稱自閉癥，是一種廣泛的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，一般于3歲前發(fā)病，嚴重影響兒童的語言形成、情緒認知與社會行為。多數(shù)患兒有明顯的語言交流艱難、社交行為障礙、重復刻板行為三大核心臨床表現(xiàn)。這些患兒不能正常入托、上學，甚至將來也無法工作。近年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)資料表明，autism的發(fā)病率逐年增多。Autism的病因不明，目前普遍認為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關鍵時期共同作用的結果。如，妊娠早期有丙戊酸鹽(Valproic acid

2、，VPA)用藥史的產婦，其子代發(fā)生autism風險大大增加。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常的信號通路傳導有關，而遺傳因素可能是信號通路傳導異常導致的基因突變所致。
　　 Writ/β-catenin信號通路對個體發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有重要的調控作用。在個體發(fā)育早期，它調控神經(jīng)細胞的增殖、分化、凋亡與遷移以及突觸的形成與聯(lián)系，調控細胞、組織及器官正常有序的分化和生長發(fā)育。然而Wnt通路猶如雙刃劍，既是調控神經(jīng)細胞正常分化

3、發(fā)育的重要通路，又是神經(jīng)發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一，通路中任何蛋白分子的異常，都將引起信號傳遞錯誤，導致細胞命運的改變，進而引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的發(fā)生，如autism。許多autism患者存在Wnt2編碼序列基因突變，故Wnt2基因是autism易感基因。敲除通路中散亂蛋白(Dishevelled，Dvl)-1基因的小鼠，表現(xiàn)出社交行為和感覺運動障礙，說明Dvl-1基因可能參與動物社會行為的形成，這可能與Dvl-1調節(jié)神經(jīng)發(fā)育有關，因為從D

4、vl-1敲除鼠組織培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育異常。Dvl-1和Dvl-2缺失的小鼠，神經(jīng)管閉合不全。β-catenin轉基因小鼠，則能使神經(jīng)前體細胞增殖，導致巨大腦、腦皮質容量增加，這可能與autism腦早期的過度增生有關。這些研究強烈提示W(wǎng)nt通路與autism的發(fā)病密切相關。
　　 近年來，大量臨床資料報道表明autism患者存在氧化應激的失調，如氧化應激生物標記物分泌增加，體內內源性抗氧化能力減少，能量代謝失調，線粒體功能障

5、礙。Dickkopf1(Dkk1)是一種分泌性的Wnt抑制劑。研究顯示，Dkk1轉染能顯著增加氧化應激產生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平。Nucleoredoxin(NRX)作為一種氧化還原劑，通過與Dvl作用，對Wnt信號通路進行負調節(jié)。H2O2作用于細胞減少了NRX和Dvl的相互作用，導致T細胞因子(T cell factor，TCF)暫時激活。而與這些結果截然相反的許多研究顯示，H2O2誘導

6、ROS依賴性的信號轉導抑制了β-catenin/TCF轉錄活性。ROS能抑制許多磷酸酶，而H2O2處理后GSK3怎么去磷酸化并不清楚。有趣的是，有研究顯示，Dvl高表達能改善H2O2誘導的β-catenin/TCF轉錄活性抑制。因此，這些研究提示ROS依賴于Dvl在調節(jié)Wnt信號通路中起雙重作用。這也說明氧化應激與Wnt信號通路之間存在關聯(lián)。
　　 那么，autism動物模型是否存在氧化應激異常?在autism產生過程中氧化應激

7、與Wnt信號通路是否存在關聯(lián)?用Wnt信號通路特異性抑制劑是否能改善autism行為學異常?目前尚不清楚。針對這些問題，本課題集中研究autism動物模型及培養(yǎng)神經(jīng)元中氧化應激與Wnt/β-catenin通路相關分子的關系，以探討autism發(fā)病的相關分子機制。我們主要進行了以下三方面的工作：
　　 一、建立并檢測了autism動物模型。采用Wistar大鼠，在妊娠第12.5天時，腹腔注射(Intraperitoneal inj

8、eeting，ip)VPA制作子代autism大鼠模型，并運用熱板致痛法、傾斜板實驗、Morris水迷宮等方法對模型大鼠進行發(fā)育與行為學檢測。結果顯示，與正常對照組比較，autism模型組大鼠腦發(fā)育異常、睜眼時間推遲、方向趨向性機能及傷害性知覺下降、游泳能力差、重復刻板動作增加、學習記憶和空間探索能力差。這些表現(xiàn)與人類autism患者的某些特征極為相似，表明用VPA注射法較成功地制作出了autism大鼠模型。
　　 二、研究了W

9、nt/β-catenin信號通路及氧化應激水平。運用Real-time PCR和Western blot技術檢測autism模型大鼠前額葉皮層(Prefrontal cortex，PFC)和海馬(Hippocampus，HC)兩腦區(qū)Wnt通路信號蛋白GSK-3β，磷酸化GSK-3β(Phosphorylated GSK-3β，P-GSK-3β)，β-catenin，磷酸化β-catenin(Phosphorylatedβ-catenin

10、，P-β-catenin)及氧化應激標記物4-羥壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)，硫氧還原蛋白(Thioredoxin，Trx)等相關分子的表達。進而我們檢測了Wnt信號通路的特異性抑制劑Sulindac對氧化應激的影響。Western Blot結果顯示，在autism模型大鼠PFC和HC腦區(qū)，Wnt通路關鍵信號蛋白失活的P-GSK-3β上調，抑制性的P-β-catenin下調，差異顯著高于對照組(P<0.001)

11、。同時，氧化應激標記物4-HNE表達增加(P<0.01)，Trx表達減少(P<0.05)。Real-time PCR結果顯示，autism模型組大鼠PFC和HC腦組織GSK-3β mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)，而β-catenin mRNA水平顯著高于對照組(P<0.01)。同時，抗氧化基因trx1，trx2 mRNA表達下調(P<0.05)。Writ信號通路的特異性抑制劑Sulindac作用以后，與autism模型大鼠相

12、比，VPA+Sulindac處理組失活的P-GSK-3β下調(P<0.05)，抑制性的P-β-catenin上調(P<0.05)，而氧化應激標記物4-HNE減少(P<0.05)。行為學研究結果顯示，與autism模型大鼠相比，Sulindac預處理，大鼠的痛閾相對正常；重復刻板動作減少；學習和記憶能力有所提高。以上結果表明，Wnt信號通路抑制劑Sulindac預處理，能削弱Wnt信號通路的亢進機能，從而減少氧化應激的發(fā)生，最終使auti

13、sm模型鼠的異常行為獲得不同程度的改善。
　　 三、采用細胞培養(yǎng)技術探討了Wnt/β-catenin通路與氧化應激在autism發(fā)生過程中的作用。應用Real-time PCR，Western blot及流式細胞分析(Flow analyticalcytometry system，F(xiàn)ACS)技術深入研究VPA處理的原代培養(yǎng)神經(jīng)元Writ/β-catcnin與氧化應激的關系。Real-time PCR及Western blot結果

14、顯示，在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中，GSK-3β mRNA及蛋白表達顯著低于對照組，失活的P-GSK-3β顯著高于對照組；而β-catenin mRNA及蛋白表達顯著高于對照組，抑制性的P-β-catenin顯著低于對照組。同時，在VPA處理培養(yǎng)神經(jīng)元中，4-HNE表達顯著高于對照組。FACS研究結果顯示，VPA處理組ROS表達水平顯著高于對照組。Sulindac處理以后，與VPA處理組相比，β-catenin蛋白表達下調，P-β-cate

15、nin表達上調，GSK-3β表達上調，P-GSK-3β表達下調，4-HNE下調。Real-time PCR結果顯示，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)處理雖然減少了ROS的產生，但是并沒有改變GSK-3β mRNA和13-catenin mRNA的表達。以上結果揭示，Wnt/β-catenin通路活性增強導致氧化應激的產生，VPA促進神經(jīng)元氧化應激的產生由于該通路上調所致。
　　 綜上所述，我們