內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)氧化應(yīng)激信號(hào)通路在糖尿病腎病發(fā)病中的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是引起終末期腎病最主要的一個(gè)原因，但其發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未闡明，缺乏有效的治療手段。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中有很重要的地位，但臨床實(shí)踐證明，目前的抗氧化治療并未能有效地遏制DN的發(fā)病和發(fā)展，故DN 發(fā)病機(jī)制的闡明以及DN 防治措施的研究已成為目前需要迫切解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。近年研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)在糖尿病、胰島素抵抗以及糖尿病相關(guān)血

2、管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖可顯著誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞ERS和氧化應(yīng)激，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚增多，揭示了ERS 可能與DN 存在密切關(guān)系。理論與實(shí)踐證據(jù)均表明ERS 很可能參與了DN的發(fā)病過程，深入探討ERS在DN 發(fā)病機(jī)制中的作用，有可能會(huì)為臨床DN 防治的研究提供新的理論依據(jù)。已經(jīng)有研究證實(shí)，應(yīng)用化學(xué)分子伴侶4-苯基丁酸(4-PBA)調(diào)控ERS 可有效抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激，減輕細(xì)胞損傷，提示氧化應(yīng)激可能受到

3、ERS的調(diào)節(jié)，然而，動(dòng)物模型中關(guān)于ERS與DN 發(fā)病機(jī)制的研究，以及調(diào)控ERS對(duì)動(dòng)物模型DN的發(fā)病和對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞的影響等效應(yīng)性研究，目前在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，這是一個(gè)亟待解決的重要問題。據(jù)此，本研究擬通過建立DN大鼠模型與高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMCs)相結(jié)合的方式，觀察DN大鼠腎組織和RMCs的ERS 激活情況和變化規(guī)律，以及腎臟病理、氧化應(yīng)激和炎癥激活的變化情況，并通過利用4-PBA調(diào)控 DN大鼠體內(nèi)和RMCs的ERS

4、強(qiáng)度，觀察其對(duì)DN大鼠生理生化指標(biāo)，以及DN大鼠腎臟和RMCs的ERS、氧化應(yīng)激、炎癥激活和細(xì)胞增殖的影響，從正反兩方面確認(rèn)ERS在DN 發(fā)病機(jī)制中的作用，并探討化學(xué)分子伴侶對(duì)DN的防治作用及其保護(hù)機(jī)制。
　　 對(duì)象和方法:
　　 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 1．采用左腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法復(fù)制DN大鼠模型，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、單純DN 模型組(DN組)和DN 模型+4-PBA 治療組

5、(DN+4-PBA組)。4-PBA 按1g/kg的劑量每日予治療組大鼠灌胃，其余兩組予等體積生理鹽水灌胃。
　　 2．各組大鼠分別于治療開始后第4、8和12周末進(jìn)行尿蛋白排泄率(UPER)、血糖(BG)、體質(zhì)量(BW)、腎質(zhì)量(KW)、血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)等的檢測(cè)。
　　 3．應(yīng)用過碘酸-希夫(PAS)染色觀察各組大鼠腎組織病理改變。
　　 4．應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組大鼠的血和尿丙二醛(MDA)

6、的含量，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組大鼠的血和尿的總超氧化物岐化酶(SOD)的活性。
　　 5．應(yīng)用氯胺T 法檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)的羥脯氨酸(HYP)含量。
　　 6．應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)p47phox和核因子相關(guān)因子2(Nrf2)的mRNA表達(dá)。
　　 7．應(yīng)用免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)磷酸化肌醇需求激酶1α(p-IRE1α）、p47phox、硝基

7、酪氨酸(NT)和Nrf2的蛋白表達(dá)。
　　 8．應(yīng)用凝膠電泳遷移率（EMSA）法檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)核轉(zhuǎn)錄因子κ B(NF-κ B)的活化情況。
　　 二、體外實(shí)驗(yàn)
　　 1．將培養(yǎng)的RMCs分為NC組、高糖組(HG組)和HG+4-PBA組。NC組予以10％胎牛血清(FBS)+RPMI 1640培養(yǎng)基，HG組予以30mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)基，HG+4-PBA組予以30mmol/L 葡萄糖+5 mmol/L 4-P

8、BA 培養(yǎng)基。在干預(yù)開始后分別于12、24和48 h 采用MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。
　　 2．應(yīng)用硫代巴比妥酸法檢測(cè)各組RMCs 培養(yǎng)上清液的MDA 含量，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各組RMCs 培養(yǎng)上清液的總SOD 活性。
　　 3．應(yīng)用氯胺T 法檢測(cè)各組RMCs 培養(yǎng)上清液的HYP 含量。
　　 4．應(yīng)用RT-PCR 法檢測(cè)各組RMCs的p47phox和Nrf2的mRNA表達(dá)。
　　 5．應(yīng)用West

9、ern blot 法檢測(cè)各組RMCs的p-IRE1α、p47phox、Nrf2和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 一、ERS在DN大鼠腎皮質(zhì)和高糖刺激的RMCs 顯著激活，其強(qiáng)度隨時(shí)間進(jìn)展而進(jìn)行性增強(qiáng)，是大鼠DN 發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。
　　 二、ERS通過調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥激活參與DN 發(fā)病過程。
　　 三、利用化學(xué)分子伴侶4-PBA 調(diào)控ERS的強(qiáng)度，能顯著抑制DN大