MicroRNA-24調(diào)控心肌梗死后纖維化過程的實驗研究.pdf

1、背景：
　　 心肌梗死后心臟重塑包括多個方面，如心肌細胞的凋亡和肥大，細胞外基質(zhì)的合成和沉積，以及血管的新生。在心肌梗死的早期，細胞外基質(zhì)的合成及沉積能加強局部的收縮力，形成瘢痕防止心臟破裂，改善心功能；然而在疾病的后期，過度的細胞外基質(zhì)沉積則會引起心肌纖維化，導(dǎo)致心功能不全，最終造成心力衰竭。有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死區(qū)域，細胞外基質(zhì)的合成和沉積會呈現(xiàn)一種持續(xù)的變化，即使在心梗后6個月直至數(shù)年時間，細胞外基質(zhì)重塑仍處于激活狀態(tài)。因

2、此，如何成功調(diào)控心肌纖維化過程，成為改善心肌梗死預(yù)后的關(guān)鍵因素。
　　 對心肌纖維化的基因治療剛剛處于起步階段，microRNA(miRNA)作為能調(diào)控多個靶點的上游調(diào)控因子越來越受到關(guān)注。已有研究證明miRNA能夠調(diào)控心臟中細胞外基質(zhì)的合成及分解代謝過程，如miR-21和miR-29調(diào)控心臟成纖維細胞膠原合成，來調(diào)控心肌肥厚的纖維化過程。但相關(guān)miRNA調(diào)控心肌梗死后心肌纖維化過程的研究罕見報道。
　　 在前期研究中，

3、通過對心肌肥厚心臟組織中心肌纖維化程度，及相關(guān)miRNA表達水平的檢測，發(fā)現(xiàn)心臟重塑會導(dǎo)致心肌纖維化，部分與此相關(guān)miRNA發(fā)生了改變，其中miR-24簇在心臟肥厚組織中改變最為明顯。
　　 研究目的：
　　 (1)明確miR-24對心臟成纖維細胞功能的影響，及其作用機制，為心肌纖維化的干預(yù)提供實驗依據(jù)。
　　 (2)明確miR-24在心肌梗死后心臟重塑過程中的作用，為臨床缺血性心臟病的治療提供新的作用靶點。

4、r>　　 方法及結(jié)果：
　　 第一部分:
　　 miR-24通過Furin-TGF-β1通路調(diào)控心臟成纖維細胞的功能
　　 1．miR-24在心臟成纖維細胞中高表達。
　　 通過qRT-PCR方法檢測心臟成纖維細胞和心肌細胞中miR-24的表達水平，顯示miR-24在心臟成纖維細胞中高表達。
　　 2．miR-24調(diào)控心臟成纖維細胞的功能。
　　 2.1 miR-24抑制心臟成纖維細胞膠

5、原合成。
　　 miR-24前體或抑制劑轉(zhuǎn)染心臟成纖維細胞，Westem-blot及qRT-PCR檢測顯示，過表達miR-24能抑制心臟成纖維細胞1、3型膠原合成。
　　 2.2 miR-24抑制心臟成纖維細胞分化成為肌樣成纖維細胞。
　　 Westem-blot及免疫組化結(jié)果顯示，過表達miR-24能抑制肌樣成纖維細胞的標記物α-SMA的表達。
　　 2.3 miR-24抑制心臟成纖維細胞增殖及遷移能力

6、。
　　 Transwell細胞遷移檢測顯示，過表達miR-24能抑制心臟成纖維細胞遷移；BrdU增殖檢測顯示miR-24能抑制心臟成纖維細胞的增殖。
　　 3．miR-24通過Furin-TGF-β1通路起作用。
　　 3.1 TGF-β1刺激造成心臟成纖維細胞中miR-24表達升高。
　　 qRT-PCR檢測顯示，心臟成纖維細胞中加入TGF-β1能刺激miR-24表達升高，而且呈現(xiàn)一定的時間劑量依賴性

7、。
　　 3.2 miR-24抑制TGF-β1通路的功能。
　　 miR-24脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染心臟成纖維細胞能抑制心臟成纖維細胞合成和分泌TGF-pi的能力，并影響其下游通路蛋白Smad2/3的磷酸化水平。
　　 3.3 miR-24通過Furin蛋白起作用。
　　 通過表達譜芯片篩選及靶點數(shù)據(jù)庫查找，推測Furin蛋白可能是miR-24的作用靶位點（Furin是一種蛋白酶，能作用于TGF-β的成熟過程）。經(jīng)m

8、iRNA過表達及抑制實驗證實miR-24能調(diào)控心臟成纖維細胞中Furin蛋白的表達水平。
　　 3.4 Furin蛋白調(diào)控心臟成纖維細胞功能。
　　 構(gòu)建Furin蛋白的小干擾RNA來抑制Furin表達，Westem-blot和qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siFurin后心臟成纖維細胞功能變化，結(jié)果顯示抑制Furin表達能夠抑制心臟成纖維細胞的分化和膠原合成能力。
　　 第二部分：
　　 miR-24改善心肌梗

9、死后心臟重塑和心功能
　　 1．miR-24在心梗區(qū)域低表達。
　　 建立小鼠心肌梗死模型，qRT-PCR檢測miR-24在心肌梗死部位及心梗周邊區(qū)的表達，顯示miR-24的表達在心肌梗死后顯著降低，在心梗后1周最為明顯，然后逐漸升高，于心梗4周后恢復(fù)正常。
　　 2．miR-24減少心梗面積，改善心功能。
　　 構(gòu)建miR-24慢病毒，用慢病毒心梗周邊區(qū)組織轉(zhuǎn)染的方法過表達miR-24，結(jié)果顯示miR-

10、24能減少心梗2周后心梗面積，改善心功能。
　　 3．miR-24抑制心梗后心肌纖維化。miR-24轉(zhuǎn)染能夠減少心肌梗死2周后，心梗周邊區(qū)及整體心臟Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達；減少成纖維細胞向肌樣成纖維細胞的分化；并減少心梗區(qū)域心臟成纖維細胞的增殖。
　　 4．miR-24調(diào)控心梗后心肌細胞凋亡。心梗組織TUNNEL染色顯示，miR-24轉(zhuǎn)染可以減少心梗1周后細胞凋亡。缺氧、血清饑餓( H/SD)聯(lián)合處理誘導(dǎo)心肌細胞凋

11、亡，miR-24表達明顯升高；轉(zhuǎn)染miR-24能抑制H/SD導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 在心臟成纖維細胞中，miR-24作用于靶點Furin蛋白來調(diào)控TGF-β1通路，進而調(diào)控心臟成纖維細胞的分化，增殖，遷移及合成膠原的能力。在小鼠心肌梗死模型中過表達miR-24能夠減少心梗周邊區(qū)的膠原沉積，并減少心肌細胞凋亡，進而減少心梗面積，改善心功能。這一研究能為心肌梗死的治療及其他心臟疾病的抗纖維化治療提供一個新的