HIV-1 p24和gp41融合基因載體的構(gòu)建以及融合蛋白在原核細胞中的表達.pdf

1、通過對中國主要流行區(qū)28名HIV-1感染者的基因亞型分析發(fā)現(xiàn),中國的HIV-1以B亞型為主,DNA直接測序發(fā)現(xiàn)p24基因和gp41基因序列相對保守.通過軟件分析,p24-gp41融合蛋白表達后,其各自的空間構(gòu)象無改變,結(jié)合位點仍然存在,為線性中和表位.因此,用基因重組技術(shù)將p24和gp41基因重組構(gòu)建質(zhì)粒,并在大腸桿菌中高效表達融合蛋白p24-gp41<'[10]>,為進一步動物試驗,研制治療性疫苗提供基礎.該課題共分三部分.第一部分H

2、IV-1p24蛋白編碼區(qū)基因變異性的研究以及p24蛋白和gp41蛋白編碼區(qū)基因片段的獲得目的:用RT-PCR方法獲得HIV-1p24蛋白編碼區(qū)基因片段以及gp41截短體蛋白編碼區(qū)基因片段.了解中國HIV感染者p24蛋白編碼區(qū)的基因變異情況.方法:抽提HIV感染者血漿中總的RNA,反轉(zhuǎn)錄成互補的DNA(cDNA),設計帶有酶切位點的引物,用巢式PCR方法擴增出所需要的目的基因片段,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證,并進行PCR產(chǎn)物的純化.使用DNA測

3、序儀直接測序;應用CLUSTALW、PHYLIP等軟件對序列進行比對及進化樹分析.第二部分 p24-gp41基因的連接以及表達載體的構(gòu)建目的:用基因重組技術(shù)將HIV-1p24基因以及gp41基因的截短體重組連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒.第三部分p24-gp41融合蛋白的表達及鑒定(Western-Blot鑒定)目的:在大腸桿菌中表達融合蛋白p24-gp41,并經(jīng)Western blot驗證.方法:將終載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)IPTG(異丙基-β-