HIV-1跨膜蛋白gp41在大腸桿菌中的表達(dá)及純化.pdf

1、1985年，法國(guó)巴斯德實(shí)驗(yàn)室從患者體內(nèi)第一次分離出1種新的逆轉(zhuǎn)錄病毒，隨后將其命名人免疫缺陷病毒( Human Immunodeficiency Virus，HIV)，該病毒感染所致的體內(nèi)CD4+T細(xì)胞顯著下降、發(fā)生機(jī)會(huì)感染及惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜合征，稱之為免疫缺陷綜合征(Acquired Immuno deficiency Syndrome，AIDS)。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，中國(guó)自1985年出現(xiàn)第一例艾滋病病人以來(lái)，截至2010年

2、11月底，累計(jì)報(bào)告艾滋病病毒感染者和病人37萬(wàn)余例。HIV是一種潛伏期極長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)和病毒核酸序列測(cè)定，將HIV分為兩型：HIV-1型與HIV-2型。除少數(shù)源于西非的毒株外，幾乎所有病例感染的都是HIV-1。在HIV-1型內(nèi)，根據(jù)包膜蛋白env基因和殼蛋白的gag基因序列，進(jìn)一步將其分為三個(gè)基因亞型（組）以及14個(gè)流行重組型，包括CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF05_DF等[2]。而在我國(guó)東

3、北地區(qū)，最常見(jiàn)為CRF01_AE亞型[3]。本文實(shí)驗(yàn)所用的HIV-1型CRF_01AE亞型gp41-cDNA目的基因均來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院艾滋病研究所。
　　 當(dāng)今，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)是診斷HIV感染的主要手段。常用的是ELISA法、免疫印跡法(WB)、p24抗原檢測(cè)及HIV抗體非傳統(tǒng)的檢測(cè)法。而這些檢測(cè)方法的基本核心原料則是HIV-1gp41抗原蛋白，因此，擁有優(yōu)質(zhì)的HIV-1gp41抗原，對(duì)于HIV快速檢測(cè)品的研制起著舉足輕

4、重的地位。研究表明，艾滋病病人的血液、尿液和唾液中都存在著HIV抗體，通過(guò)抗原-抗體的特異結(jié)合反應(yīng)，達(dá)到檢測(cè)品的檢測(cè)原理。另外，據(jù)最新報(bào)道，感染HIV病毒的各期病人尿液中均含有抗艾滋病病毒的抗體。因此，用尿液代替血液檢測(cè)HIV抗體，為HIV診斷試劑的發(fā)展提供了新方向。采用尿液檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)有：一、由于HIV感染者的尿液中僅含有HIV抗體，而不是有著傳染性的病毒本身，因此HIV不通過(guò)尿傳播，可以安全地收集和運(yùn)輸尿樣到實(shí)驗(yàn)室；二、采樣簡(jiǎn)便，可在

5、任意時(shí)刻采取尿樣檢測(cè)，便于大規(guī)模篩查，無(wú)需針頭取血，減少醫(yī)患之間傳播的危險(xiǎn)；三、尿液無(wú)需濃縮和預(yù)處理，抗HIV-1抗體可在尿液中長(zhǎng)期存在（2℃-8℃可保持一年；在15℃-0℃可保持55天）。四、快速，全部檢測(cè)過(guò)程僅需10-15分鐘；五、肉眼判定結(jié)果，隨時(shí)隨地進(jìn)行價(jià)格低廉：不需要特殊培訓(xùn)和特殊儀器。另外，在研制尿液HIV快速診斷試紙條的過(guò)程中，所需的HIV-1gp41抗原購(gòu)自于SANTA公司（美國(guó)）和一些國(guó)內(nèi)公司，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：國(guó)外HIV-1

6、gp41抗原蛋白優(yōu)質(zhì)但價(jià)格昂貴，而國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的則效果不好且價(jià)格不菲，于是便產(chǎn)生了本實(shí)驗(yàn)的構(gòu)想，自己親自表達(dá)出HIV-1gp41抗原蛋白，不僅保證了充裕的原材料，而且也節(jié)省了開(kāi)資，為研制高靈敏度HIV檢測(cè)試紙條提供依據(jù)。
　　 目的：
　　 從獲得的HIV-1型CRF_01AE亞型gp41-cDNA目的基因后，通過(guò)對(duì)HIV全基因組基因序列的比對(duì)，選擇HIV-1型外膜蛋白env-gp41中保守區(qū)(5796-8369)中的部分基

7、因片（7311-8366，共計(jì)1055bp）進(jìn)行基因擴(kuò)增；并將其與T載體連接后，克隆入表達(dá)載體pET28a內(nèi)，構(gòu)建重組載體pET28a-gp41-T載體，在E.colib121TM中表達(dá)該蛋白并摸索其表達(dá)量的最適條件，最終純化出優(yōu)質(zhì)抗原蛋白。
　　 方法：
　　 對(duì)HIV-1的外膜蛋白env進(jìn)行修飾，并利用巢式PCR技術(shù)克隆env-gp41基因，同時(shí)引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，并與T載體相連接，構(gòu)建出gp41-T載

8、體，同時(shí)對(duì)pET28a進(jìn)行雙酶切，低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳回收gp41-T載體、pET28a片段后，采用T4DNA連接酶將兩片段連接。酶切鑒定及測(cè)序鑒定后，將正確重組的質(zhì)粒pET28a-gp41-T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.colibl21TM(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用SDS-PAGE、Westernblot、ELISA檢測(cè)法對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，表明目的基因表達(dá)成功。然后對(duì)其進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行蛋白純化及除鹽，對(duì)最終純化出的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)

9、定和驗(yàn)證，為進(jìn)一步獲得優(yōu)質(zhì)的HIV-1gp41抗原奠定了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)果：
　　 成功構(gòu)建出pET28a-gp41表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)多種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及測(cè)序鑒定，最終結(jié)果表明，構(gòu)建后的env-gp41基因能在16℃誘導(dǎo)的條件下表達(dá)，對(duì)表達(dá)的env-gp41蛋白進(jìn)行純化、除鹽，最終得出較好的免疫原性的env-gp41蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 正確重組克隆的pET28a-gp41，37℃時(shí)在大腸桿菌BL21(sta

10、r)中未見(jiàn)其表達(dá)，而在16℃條件下誘導(dǎo)，可見(jiàn)其表達(dá)，主要原因可能是env蛋白對(duì)原核系統(tǒng)產(chǎn)生毒性所致，而低溫可以有效降低這種細(xì)胞膜的毒性作用，減少宿主菌的死亡，從而成功表達(dá)。在pET28a-gp41轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(star)后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌生長(zhǎng)變得非常緩慢，與空載體轉(zhuǎn)化后的菌相比需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到誘導(dǎo)所需的光密度值。另外，在gp41的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)有莖一環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)表達(dá)可能有一定的影響，gp41蛋白的穿膜作用可能是影響en