HIV-1核心抗原p24基因的表達(dá)、純化、鑒定及應(yīng)用性研究.pdf

1、研究背景及目的:艾滋病是目前人類(lèi)面臨的最嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)2011年統(tǒng)計(jì)，全球艾滋病毒感染者仍有3400萬(wàn)人，其中新增感染者為250萬(wàn)，另有170萬(wàn)人死于與艾滋病有關(guān)的疾病。此外，還有680萬(wàn)感染者無(wú)法及時(shí)得到醫(yī)治，所以艾滋病防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻。由于HIV本身的反復(fù)突變，對(duì)HIV疫苗的研制至今也尚未成功。因此，目前能與之抗?fàn)幍淖钣行У氖侄稳砸灶A(yù)防為主，能否對(duì)HIV感染做出快速準(zhǔn)確的診斷是阻止其流行擴(kuò)散的關(guān)鍵，因?yàn)閷?duì)每位HIV感染者血清狀況

2、的了解有助于防止感染的再次傳播。
　　 HIV編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因包括Gag、Pol、Env。gag基因產(chǎn)生55kDa蛋白p55。p55由病毒編碼的一個(gè)蛋白酶切成四個(gè)小蛋白:MA(p17基質(zhì))、CA(p24衣殼)、NC(p9核衣殼)及p6。p24是HIV病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的包裝和成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之間高度保守，缺失p24的病毒無(wú)法正常組裝。HIV感染人體后，感染者血液中首先出現(xiàn)

3、的病毒標(biāo)志物為病毒p24蛋白。由于從病毒感染到檢出抗HIV抗體之間存在較長(zhǎng)的窗口期，因此，HIV-1 p24抗原檢測(cè)在HIV感染的早期診斷、預(yù)后判斷、抗HIV藥物篩選及判斷母嬰傳播等方面具有重要意義。
　　 目前，對(duì)HIV感染的檢測(cè)方法包括抗體檢測(cè)、p24抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)以及CD4+T淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)等。由于從感染HIV到出現(xiàn)可檢測(cè)的抗體尚有一段時(shí)間，因此雖然抗-HIV抗體檢測(cè)的ELISA試劑經(jīng)歷了4代發(fā)展，但其“窗口期”問(wèn)題

4、仍不可避免，而可以進(jìn)一步縮短“窗口期”的核酸檢測(cè)和CD4+T淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)，由于檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)且需要特殊儀器而不易普及。
　　 HIV感染機(jī)體后的1～2周，血液中首先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物為核心蛋白p24，病毒感染1～2個(gè)月內(nèi)才能產(chǎn)生特異性抗體，所以?xún)H是檢測(cè)抗HIV抗體存在較長(zhǎng)的檢測(cè)窗口期。國(guó)外已經(jīng)成功研制了HIV抗原和抗體聯(lián)合測(cè)定的酶免試劑盒并用于HIV感染的檢測(cè)。p24抗原的測(cè)定主要用于HIV感染的早期檢測(cè)，可縮短感染

5、HIV病毒到檢出的窗口期至12～15d，在現(xiàn)有的HIV抗體測(cè)試劑中加入p24抗原的檢測(cè)功能，用于獻(xiàn)血員的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，可有效地避免窗口期的漏檢，減少HIV傳播的可能。
　　 HIV侵入機(jī)體后，核心抗原p24的水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，并在急性感染期即可出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制的間接標(biāo)志，與病情發(fā)展密切相關(guān)。因此，血液及其它體液標(biāo)本中p24抗原的檢測(cè)可以縮短窗口期，有助于HIV的早期診斷、預(yù)后判斷及評(píng)價(jià)抗病毒治療

6、的效果，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　 時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）是一種靈敏的高端定量免疫檢測(cè)技術(shù)，是以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，因鑭系稀土離子具有獨(dú)特的熒光特性，該技術(shù)能夠獲得極高的信噪比，從而具有很高的靈敏度，且還具有標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)放射性污染、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應(yīng)用范圍十分廣泛等優(yōu)點(diǎn)。時(shí)間分辨熒光免疫分析相對(duì)于酶免分析、放射免疫分析有更高的臨

7、床應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)適用于各種抗原抗體的臨床檢測(cè)，在市場(chǎng)上已得到廣泛應(yīng)用。有必要再開(kāi)發(fā)出高靈敏度的HIV抗原的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于臨床檢測(cè)，完善產(chǎn)品群。
　　 方法:
　　 1.p24表達(dá)工程菌的構(gòu)建及鑒定:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了p24基因，并進(jìn)行核酸電泳鑒定大小。擴(kuò)增出的目的基因片段測(cè)序并與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，然后將編碼基因克隆到pET-28a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒中，經(jīng)PCR、限制性酶切分析等鑒定后

8、轉(zhuǎn)化B121(DE3)大腸桿菌，構(gòu)建p24-pET28a(+)/BL21原核表達(dá)工程菌。
　　 2.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，HIV-1 p24基因在大腸桿菌E.coli DE3中表達(dá)His-tag融合重組蛋白。超聲破菌后用親和層析法純化重組蛋白，透析、復(fù)性得到有活性的目的蛋白。用陽(yáng)性病人血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析和間接ELISA分析，鑒定所表達(dá)的p24抗原的活性與抗原性。
　　

9、 3.用雙抗體夾心法研制人免疫缺陷病毒抗原時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑
　　 3.1以正常人血清作為陰性對(duì)照，以正常人血清稀釋p24抗原作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　 3.2包被用的HIV p24單抗和標(biāo)記用的二抗均購(gòu)自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司，對(duì)照用的HIV p24抗原購(gòu)自深圳菲鵬生物股份有限公司。
　　 3.3 Eu3+標(biāo)記抗體的制備。
　　 3.4采用棋盤(pán)滴定法對(duì)最佳包被量及標(biāo)記抗體最佳稀釋度進(jìn)行確定。

10、　　 3.5參考值范圍:以自制的p24-TRFIA試劑檢測(cè)80份健康人血清，統(tǒng)計(jì)血清p24抗原水平的分布情況，計(jì)算樣本熒光值與陰性對(duì)照的比值。取比值的平均值，以比值均值加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，初步確定為正常人參考值，再綜合其他文獻(xiàn)研究資料及臨床現(xiàn)行參考值范圍，最終確定參考值范圍。
　　 3.6性能評(píng)價(jià)
　　 3.6.1劑量反應(yīng)曲線和精密性;
　　 3.6.2特異性分析;
　　 3.6.3抗干擾性分析;
　　

11、 3.6.4穩(wěn)定性;
　　 3.6.5臨床血樣的測(cè)試結(jié)果
　　 1.HIV-1 p24-pET28a(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了p24基因。核苷酸序列測(cè)定顯示，其大小為693bp，與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該DNA片段的核苷酸序列與已報(bào)道的p24基因序列一致，無(wú)移碼突變。并且成功的將p24基因克隆到pET28a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切和測(cè)序等鑒定，證實(shí)成功構(gòu)建了p24-

12、pET28a(+)重組原核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2.p24抗原的表達(dá)、純化及鑒定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒p24-pET28a(+)在大腸桿菌BL21中表達(dá)出p24的融合蛋白，分子量約為26kDa，與理論值基本符合，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。重組蛋白經(jīng)過(guò)包涵體洗滌，Ni親和層析純化后，純度均達(dá)80％以上。用HIV陽(yáng)性血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，顯示在26kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，間接ELISA亦顯示，該p24

13、抗原與陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表明該重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性。
　　 3.雙抗體夾心法研制人免疫缺陷病毒抗原時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑
　　 3.1.綜合考慮本底信號(hào)值、信噪比等因素，選擇2μg/mL作為最佳包被抗體濃度，1∶200作為標(biāo)記抗體的最佳稀釋度。
　　 3.2.參考值范圍:80份查體者血清，檢測(cè)熒光值與陰性對(duì)照比值平均值(X)為1.3422，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.67，均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差等于2.68，而

14、當(dāng)檢測(cè)熒光值與陰性對(duì)照比值在2.1以下時(shí)，包含了99.0％的樣本。據(jù)此設(shè)定本方法檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為:cutoff值=陰性對(duì)照熒光值×2.1。
　　 3.3.性能評(píng)價(jià)的結(jié)果顯示
　　 3.3.1HIV p24抗原時(shí)間分辨熒光免疫分析法在檢測(cè)時(shí)不受甘油三酯（體積比5％）、膽紅素(0.32mg/mL)、血紅蛋白(180mg/mL)的干擾，無(wú)假陽(yáng)性、假陰性出現(xiàn)，特異性符合臨床診斷的要求。
　　 3.3.2自制反應(yīng)模式

15、檢測(cè)乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體抗體的陽(yáng)性樣本，結(jié)果均為HIV抗原陰性，說(shuō)明自制反應(yīng)體系檢測(cè)血樣時(shí)不受這些因素的干擾。
　　 3.3.3該反應(yīng)體系放置于37℃7天，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合要求，穩(wěn)定性較好。
　　 3.3.4該方法測(cè)試的24份抗體陽(yáng)性的血清中有6份p24抗原陽(yáng)性結(jié)論以上結(jié)果表明，本研究成功地構(gòu)建了p24-pET28a(+)原核重組表達(dá)系統(tǒng)，并在大腸桿菌BL21中大量表達(dá)與目標(biāo)蛋白的大小一致融合蛋白，分

16、子量約26kDa。經(jīng)過(guò)Wester Blot和間接ELISA鑒定表明，本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的p24抗原能被HIV陽(yáng)性病人血清特異性識(shí)別。因此，本研究表達(dá)的p24抗原具有較強(qiáng)免疫活性。
　　 HIV p24抗原的雙抗體夾心時(shí)間分辨熒光免疫分析法的各項(xiàng)指標(biāo)（靈敏度、精密性、特異性、穩(wěn)定性等）均能夠滿足臨床檢測(cè)試劑要求，臨床考核合格，但是受HIV的血樣收集的限制，血樣不是很多，待收集到更多的血樣，在本方法中進(jìn)行檢測(cè)，并與國(guó)家食品與藥品監(jiān)督管理局