中國HIV-1感染者gp41中和表位變異及中和抗體水平的研究.pdf

1、目的:人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)自1981年發(fā)現(xiàn)以來，在全球以驚人的速度蔓延，己成為人類健康和社會(huì)進(jìn)步的大敵。由于HIV高度變異的生物學(xué)特性，艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)目前尚無法徹底治愈，也無有效的疫苗問世。理想的疫苗應(yīng)能夠誘發(fā)高滴度的中和抗體和特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL

2、)應(yīng)答。HIV的中和抗體是指機(jī)體感染病毒后由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能夠與HIV病毒結(jié)合并具有抑制或阻止其識別、結(jié)合感染宿主細(xì)胞功能的特異性抗體。HIV-1主要免疫原為gp160，由gp120和gp41三聚體組成，由于跨膜蛋白gp41結(jié)構(gòu)線性且相對保守，在融膜過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，所以針對gp41結(jié)構(gòu)域的中和抗體研究是目前疫苗研究的新靶點(diǎn)。
　　 分析gp41保守表位及gp41中和抗體的水平是針對gp41疫苗設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。識別gp41

3、近膜端的兩個(gè)單克隆抗體2F5和4E10，具有廣泛中和活性，晶體結(jié)構(gòu)及結(jié)合位點(diǎn)明確。近期研究顯示，2F5和4E10及其組合在體外能夠中和不同亞型分離株，保護(hù)免疫動(dòng)物不受HIV感染，且HIV感染者被動(dòng)輸入2F5及4E10單抗時(shí)能夠使病毒反彈延遲。中和抗體逃逸和中和抗體的濃度是影響中和抗體發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素之一。國外近年發(fā)現(xiàn)，隨著疾病進(jìn)展，gp41中和抗體識別表位氨基酸發(fā)生不同程度的突變，使得中和抗體能力下降或消失。有研究表明泰國CRF01_

4、AE無癥狀HIV_1感染者血漿中的2F5抗體水平高于AIDS患者。對中和抗體抗原表位的研究是分析抗原分子的結(jié)構(gòu)與功能、抗原抗體反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ)。尋找與中和抗體特異性結(jié)合的gp41模擬表位及分析相應(yīng)的抗原表位將有助于設(shè)計(jì)免疫原誘導(dǎo)保護(hù)性抗體，CSGKLIC(gp41603～609aa)和ERDRD(gp41746～750aa)是最近發(fā)現(xiàn)的gp41中和表位。
　　 目前，對于我國流行HIV gp41中和表位及中和抗體的研究仍是空白。由

5、于存在人種的免疫特異性及遺傳背景差異，且我國流行的HIV毒株不同于國外，使得對于中和抗體的研究無法照搬國外研究結(jié)果，因此急需掌握我國HIV gp41中和表位變異及中和抗體水平的基本情況。本研究以中國HIV-1感染者為對象：分析gp41中和抗體保守表位變異與亞型、疾病進(jìn)程的相關(guān)性；探討gp41的中和抗體水平與疾病進(jìn)程及中和能力的相關(guān)性；應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫尋找gp41抗體識別的模擬性表位，為中國HIV-1 gp41中和抗體的免疫治療和疫苗設(shè)

6、計(jì)奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、研究對象；
　　 2、CD4+T淋巴細(xì)胞測定；
　　 3、病毒載量測定；
　　 4、病毒核酸提?。?br>　　 5、巢氏聚合酶鏈反應(yīng)(nest-PCR)；
　　 6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化；
　　 7、TOPO-TA克??；
　　 8、PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序；
　　 9、序列分析；
　　 10、HIV-1中和抗體實(shí)驗(yàn)；

7、>　　 11、ELISA；
　　 12、分離血漿IgG；
　　 13、親和淘篩及陽性克隆篩選；
　　 14、噬菌體提?。?br>　　 15、ELISA檢測挑選陽性克??；
　　 16、噬菌體單鏈DNA提取、測定；
　　 17、噬菌體多肽競爭抑制實(shí)驗(yàn)；
　　 18、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)論:
　　 1、中國92例HIV/AIDS患者HIV-1包膜蛋白envgp41段中和抗體

8、2F5、4E10中和表位氨基酸存在突變，且變異多樣化。不同亞型中和抗體保守表位氨基酸位點(diǎn)變異有差異；
　　 2、B'亞型4E10中和抗體表位變異可能與疾病進(jìn)程有一定聯(lián)系。中國HIV-1感染者自然狀態(tài)下的血漿病毒中和表位變異可導(dǎo)致2F5和4E10單抗完全或部分逃逸；
　　 3、中國SP體內(nèi)2F5抗體水平高于AS和AIDS患者，可能是疾病不進(jìn)展的相關(guān)因素，2F5抗體水平與gp41特異性抗體呈正相關(guān)，與總的中和抗體水平無相關(guān)性