神經(jīng)肽SP對NK92-MI細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究.pdf

1、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)對機(jī)體免疫功能具有重要的調(diào)控作用。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽是直接作用于免疫活性細(xì)胞和其他參與免疫反應(yīng)細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)。P物質(zhì)(Substance P,SP)是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽之一,屬于哺乳動物速激肽家族。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是SP的主要來源,免疫細(xì)胞是SP的另一來源。外周神經(jīng)末梢釋放SP參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程,免疫細(xì)胞產(chǎn)生SP以自分泌或/和旁分泌的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。SP可從多方面影響各種免疫細(xì)胞,且SP在

2、不同條件下所起的作用具有復(fù)雜性和多樣性。SP可以影響淋巴細(xì)胞的增殖、分化,誘導(dǎo)免疫球蛋白和細(xì)胞因子的合成,并能夠調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的活性和其他一些免疫細(xì)胞的活性,通過以上作用參與調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。SP是通過與速激肽受體(TK-R)的亞型NK-1(neuorkinin-1),NK-2,NK-3受體的結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)活性的,其中SP與NK-1R的親和力最高,對NK-2R和NK-3R有較低的親和力,既SP發(fā)揮生理作用的主要途徑是NK-

3、1受體。SP受體分布于神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞。在免疫系統(tǒng),SP受體幾乎分布于各種免疫細(xì)胞,包括T、B淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。
　　 自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells)參與免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展及效應(yīng)等重要環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)過程,是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者,也是獲得性免疫的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞,NK細(xì)胞無需特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染

4、的細(xì)胞。NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞主要是通過與靶細(xì)胞直接接觸,分泌殺傷介質(zhì)穿孔素、顆粒酶、TNF和NK細(xì)胞毒因子(LT)等導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。另一方面,NK細(xì)胞還可分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、LT、IL-8和IL-5等有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子來間接殺傷靶細(xì)胞。NK細(xì)胞功能的發(fā)揮主要依賴于NK細(xì)胞能表達(dá)多種與主要組織相容性抗原(MHC)和非MHC類配體結(jié)合的受體,傳遞抑制和激活信號,NK細(xì)胞的殺傷活性取決于激活信號與抑制信號的平衡。目前

5、發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞表面的活化性受體包括自然細(xì)胞毒受體(Natural cytotoxicity receptors,NCRs)、NKG2D、活化殺傷免疫球蛋白樣受體(Killer immunogloblin-like receptors,KIRs)及其他輔助刺激活化性受體2B4、DNAM-1、NTB-A、CD59等。
　　 目前,有關(guān)SP對NK細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控及作用機(jī)制的研究,國內(nèi)外尚少見報道。已有一些研究證據(jù)表明SP對NK細(xì)胞

6、的調(diào)節(jié)作用,但其作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究以非IL-2依賴的NK92-MI細(xì)胞株為研究體系,首先研究了SP對NK92-MI細(xì)胞增殖活性和殺傷活性等功能的影響,并分析了殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的表達(dá)和釋放與SP增強(qiáng)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的關(guān)系。其次研究了SP對NK92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs表達(dá)的影響,進(jìn)一步闡明SP對NK92-MI細(xì)胞功能的調(diào)控作用及內(nèi)在作用機(jī)制。最后我研究了SP受體(NK-1R、2R、3R)在NK92-M

7、I細(xì)胞上的組成性表達(dá),以及SP對NK92-MI細(xì)胞NK-1R、2R、3R表達(dá)的影響,并檢測了SP作用于NK-92MI細(xì)胞后其胞漿Ca2+濃度的變化,探討SP調(diào)控NK92-MI細(xì)胞功能的受體途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。以揭示SP對NK細(xì)胞生物學(xué)活性調(diào)控作用的機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)：NK92-MI細(xì)胞株為非IL-2依賴性NK92細(xì)胞株(NK92細(xì)胞來自一個進(jìn)行性非霍奇金淋巴瘤患者,1998年建系),購自中科院

8、上海細(xì)胞庫；用含12.5％胎牛血清和12.5％馬血清的α-MEM培養(yǎng)基(不含RNA和DNA)傳代培養(yǎng)。
　　 2.MTT法測定SP對NK92-MI細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 3.MTT法測定SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響。
　　 4.RT-PCR測定NK92-MI細(xì)胞NK-1R、2R、3R的組成性表達(dá)。
　　 5.Real-Time PCR法測定SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)

9、、NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)以及SP受體(NK-1R、2R和3R)的mRNA表達(dá)的影響。
　　 6.Western-Blot法測定SP對NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的蛋白表達(dá)的影響。
　　 7.β-己糖胺酶釋放實驗測定sP對NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B釋放的影響。
　　 8.流式細(xì)胞術(shù)檢測SP對NK92-MI細(xì)胞NKp44、NKp46、NKp30分子和NK-1R的膜表達(dá)的影響。

10、r>　　 9.Fura-2/AM熒光探針法測定NK92-MI細(xì)胞胞漿Ca2+濃度。
　　 10.統(tǒng)計學(xué)分析所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way.ANOVA),p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、SP對NK92-MI細(xì)胞的促增殖作用經(jīng)一定濃度(10-14～10-6M)的SP作用24h后,NK92-MI細(xì)胞的增殖無明顯變化,作用48h后,

11、10-12～lO-6M的SP對NK92-MI細(xì)胞的增殖均有明顯促進(jìn)作用。
　　 二、SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)作用一定濃度(10-14～10-6M)的SP作用24h,除較高濃度10-6M外,10-14～10-8M的SP對NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性均顯示有明顯增強(qiáng)作用。
　　 三、SP對NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B表達(dá)的影響
　　 1.SP增加NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的mRNA表達(dá)選擇

12、對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(10-14～10-10M)的sP作用NK92-MI細(xì)胞24h,各濃度的SP均可顯著提高NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的mRNA表達(dá)水平。
　　 2.SP增加NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的蛋白表達(dá)選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI細(xì)胞24h,各濃度SP均可增加NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B的蛋白表達(dá),僅10-14M的SP對

13、穿孔素的表達(dá)無明顯作用。
　　 四、SP對NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B釋放的影響選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI細(xì)胞24h后,NK92-MI細(xì)胞的β-己糖胺酶釋放無明顯變化,表明SP對穿孔素和顆粒酶的釋放無明顯影響。
　　 五、SP對NK92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)表達(dá)的影響
　　 1.SP增加NK

14、92-MI細(xì)胞活化性受體NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)的mRNA表達(dá)選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP作用NK92-MI細(xì)胞24h,各濃度的SP均可顯著增加NK92-MI細(xì)胞NCRs的mRNA表達(dá)。
　　 2.SP對NK92-MI細(xì)胞NCRs膜表達(dá)的作用選擇對殺傷活性增強(qiáng)作用較大的濃度(10-14M、10-12M、10-10M)的SP處理NK92-MI細(xì)胞24h,各

15、濃度的SP均可增加NKp46的膜表達(dá);僅較低濃度(10-14M)的SP對NKp44的膜表達(dá)有增加作用;各濃度的SP對NKp30的膜表達(dá)均無明顯作用。
　　 六、NK-1R在NK92-MI細(xì)胞上的功能性表達(dá)
　　 1.SP誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞NK-1R的mRNA表達(dá)及膜表達(dá)增加一定濃度(10-14～10-6M)的SP作用NK92-MI細(xì)胞1、4和24h后,各濃度SP作用較短時間(4h)即可增加NK92-MI細(xì)胞NK-1R

16、的mRNA表達(dá)。SP作用NK92-MI細(xì)胞24h后,10-14～10-8M的SP均能明顯增加NK92-MI細(xì)胞NK-1R的膜表達(dá)。
　　 2.NK-1R特異性拮抗劑對SP調(diào)控NK92-MI細(xì)胞功能的阻斷作用使用NK-1R特異性拮抗劑可完全阻斷SP對NK92-MI細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用;大部分阻斷SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)作用;大部分阻斷SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的mRNA表達(dá)的增加作用。

17、r>　　 七、SP誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞NK-2R、3R的mRNA表達(dá)增加NK92-MI細(xì)胞組成性表達(dá)NK-2R、3R。SP作用1、4、24h后,可誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞NK-2R、3R的mRNA表達(dá)增加,NK-2R的mRNA表達(dá)在4h時開始增加,24h時達(dá)到最高;NK-3R的mRNA表達(dá)趨勢與NK-1R相似,在4h時表達(dá)最高。
　　 八、SP提高NK92-MI細(xì)胞胞漿游離Ca2+的濃度一定濃度(10-14～10-6M)的SP

18、作用NK92-MI細(xì)胞1h后,NK92-MI細(xì)胞胞漿Ca2+的濃度明顯增高。
　　 結(jié)論：
　　 1.10-14～10-6M濃度范圍的神經(jīng)肽SP對NK92-MI細(xì)胞的增殖活性和殺傷活性有促進(jìn)作用。
　　 2.所觀察濃度范圍的SP可增加NK92-MI細(xì)胞殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá);SP對NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)作用,是通過直接增加其殺傷介質(zhì)(穿孔素和顆粒酶B)的表達(dá)來實現(xiàn)的。

19、>　　 3.所觀察濃度范圍的SP可誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞中NCRs(主要是NKp46分子)的表達(dá)增加,說明SP可以作為一種活化因子來調(diào)節(jié)NK92-MI細(xì)胞的功能;且SP可以通過增加活化性受體的表達(dá)來間接調(diào)節(jié)NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性。
　　 4.NK92-MI細(xì)胞組成性表達(dá)NK-IR、2R、3R;SP通過與其受體NK-1R的正反饋機(jī)制來調(diào)節(jié)NK92-MI細(xì)胞功能;SP對NK92-MI細(xì)胞功能的調(diào)控,可能有NK-1R、2R、3