外源性MICA分子對內皮細胞生物學功能的影響及介導NK細胞殺傷作用的實驗研究.pdf

1、近幾年來，主要組織相容性復合體-I類相關鏈A(major histocompatibility complexclass I-related chain A，MICA)抗體與實體器官移植特別是腎移植的排斥反應和移植腎長期存活率之間的關系成了移植免疫學基礎和臨床研究的熱點。在等待腎移植的患者體內檢測到了預存的MICA抗體，說明在移植前患者就接觸到了MICA抗原而產生了特異性的抗體；移植后MICA抗體與免疫排斥反應和慢性移植腎失功之間均存在

2、著密切的關系。由于MICA蛋白可以表達在血管內皮細胞表面，但不表達在T淋巴細胞，因而MICA分子可能直接引起移植腎血管的損傷，進而導致移植腎功能損害。有學者研究了MICA抗原對淋巴細胞生物學特性的影響，發(fā)現MICA抗原對T細胞和B細胞有促進其增殖的作用。最近對心臟移植的研究中發(fā)現，血清中的可溶性MICA(sMICA)分子可以減輕移植物的免疫損傷，對移植物起到保護作用。MICA分子和NKG2D是互為配受體的關系，且NKG2D是NK細胞表面

3、的一種激活性受體。但是MICA抗原對內皮細胞的生物學特性的影響，sMICA在腎移植中的是否有保護作用，以及NK細胞能否被激活而對內皮細胞產生殺傷作用，均未見報道。
　　 因此，本課題將分三個部分進行研究：(1)應用MICA重組蛋白對血管內皮細胞進行刺激，觀察它對內皮細胞的生物學特性及其分泌功能的影響：(2)外源性抗原對內皮細胞MICA基因表達的調節(jié)作用，以及對細胞上清中sMICA的水平的影響；(3)表達MICA分子的內皮細胞與N

4、K細胞共同培養(yǎng)，觀察NK細胞對內皮細胞的殺傷作用，并探討其可能的作用機制。
　　 第一部分 MICA抗原對內皮細胞生物學功能的影響
　　 目的：觀察主要組織相容性復合體-I類相關鏈A(MICA)抗原對血管內皮細胞生物學功能的影響。
　　 方法：將外源性重組MICA蛋白分A5(5ng/ml)，A10(10ng/ml)，A25(25ng/ml)三個劑量加入培養(yǎng)基中作為實驗組，A0組加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)作

5、為對照組，對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)予以培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測其細胞周期和凋亡情況，采用噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖情況，并測定各組細胞上清液中前列環(huán)素代謝產物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGFlα)、內皮素(ET-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI)的水平。
　　 結果：各實驗組(A5，A10，A25)內皮細胞A570值均高于對照組(A0)。以A5組增殖最為明顯，A10組比A5組稍下

6、降，兩組之間差異統計學意義（P>0.05），但明顯高于A25組差異有統計學意義(P<0.05）。在相同劑量下48h時增殖率最高，A570值分別為0.458，0.446，0.389。72h和96h呈持續(xù)緩慢增殖，隨著時間延長增殖率逐漸下降，差異有統計學意義(P<0.05）。A10，A25組細胞上清中的6-keto-PGF1α水平分別為144.6，132.8pg/ml，A0，A5組分別為226.5，232.6pg/ml; A10，A25組E

7、T-1水平分別為23.6，25.8pg/ml，A0，A5組分別為11.8，10.4pg/ml。A10，A25組和Ao，A5組比較，差異均有統計學意義(P<0.05）；而A10與A25組比較，A0與A5組比較，差異均無統計學意義(P>0.05）。各實驗組(A5，A10，A25)t-PA、PAI分別為161.2，154.2，157.8ng/ml;221.6，248.5，252.4ng/ml;而對照組（A0)分別為233.5ng/ml、137

8、.8ng/ml。實驗組和對照組之間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而各實驗組之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05）。各實驗組細胞無明顯凋亡，細胞周期也無明顯改變。
　　 結論：MICA抗原對內皮細胞的生長周期無明顯影響，也不引起其凋亡，但能刺激內皮細胞增殖，以小劑量誘導增殖明顯，并呈持續(xù)緩慢增殖。同時能夠引起內皮細胞功能受損，凝血功能增強，而纖溶功能下降，有助于血栓形成。
　　 第二部分外源性抗原對內皮細

9、胞MICA基因表達的影響
　　 目的：探討外源性抗原對內皮細胞MICA基因表達的影響。
　　 方法：將MICA重組蛋白分A5(5ng/ml)，A10(10ng/ml)，A25(25ng/ml)和熱休克蛋白(HSP-70)分B5(5ng/ml)，B10(10ng/ml)，B2s(25ng/ml)各三個劑量的實驗組，對內皮細胞(HUVEC)予以誘導培養(yǎng)，對照組A0、B0組分別加等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。采用實時熒光定量P

10、CR方法檢測內皮細胞MICA mRNA表達、Western blot法檢測MICA蛋白和流式細胞儀檢測MICA蛋白在細胞膜表面的表達，用ELISA法測定細胞上清液中可溶性MICA(sMICA)的水平。
　　 結果：用三個劑量MICA重組蛋白誘導48h后，各實驗組(A5，A10，A25)內皮細胞MICA mRNA和MICA蛋白的表達量與對照組比較均有顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。A5組和AIO組MICA mRNA和

11、MICA蛋白均高于A25組，而且差異均有統計學意義(P<0.05）；但A5組與A10組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。MICA膜蛋白表達以A10組(32.6％)最高，并與A5組(28.2％)、A25組(23.4％)之間有顯著性差異(P<0.05）。各實驗組(A5，A10，A25)sMICA水平分別為35.8、27.4、21.8pg/ml，較對照組(A0，352.5pg/ml)顯著下降，且差異均有統計學意義(P<0.05），而各

12、實驗組之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05）。而HSP蛋白組內皮細胞MICA基因的表達和sMICA水平無明顯改變。
　　 結論：外源性MICA抗原能夠誘導內皮細胞自身MICA mRNA、總蛋白和膜蛋白表達上調，尤其是細胞膜蛋白增加明顯，但sMICA水平顯著下降，而HSP蛋白組無顯著變化。
　　 第三部分 MICA分子介導NK細胞對內皮細胞的殺傷作用
　　 目的：觀察MICA分子在NK細胞殺傷內皮細胞過程中的

13、作用，探討其可能的機制。
　　 方法：使用免疫磁珠方法及CD56陽性分選試劑盒分選NK細胞，并將NK細胞與表達MICA膜蛋白的活化內皮細胞，共同培養(yǎng)10h。NK細胞與A0組HUVEC（同第二部分）共培養(yǎng)為A組，與A10組為B組。用熒光素進行染色，在熒光顯微鏡下觀察死亡和存活細胞數量，計算NK細胞對內皮細胞殺傷效率，用ELISA法測定細胞上清中的干擾素-γ(IFN-γ）和穿孔素水平。
　　 結果：免疫磁珠法可以分選NK細胞