外源性MICA分子對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及介導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近幾年來，主要組織相容性復(fù)合體-I類相關(guān)鏈A(major histocompatibility complexclass I-related chain A，MICA)抗體與實(shí)體器官移植特別是腎移植的排斥反應(yīng)和移植腎長期存活率之間的關(guān)系成了移植免疫學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。在等待腎移植的患者體內(nèi)檢測到了預(yù)存的MICA抗體，說明在移植前患者就接觸到了MICA抗原而產(chǎn)生了特異性的抗體；移植后MICA抗體與免疫排斥反應(yīng)和慢性移植腎失功之間均存在

2、著密切的關(guān)系。由于MICA蛋白可以表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，但不表達(dá)在T淋巴細(xì)胞，因而MICA分子可能直接引起移植腎血管的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致移植腎功能損害。有學(xué)者研究了MICA抗原對淋巴細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，發(fā)現(xiàn)MICA抗原對T細(xì)胞和B細(xì)胞有促進(jìn)其增殖的作用。最近對心臟移植的研究中發(fā)現(xiàn)，血清中的可溶性MICA(sMICA)分子可以減輕移植物的免疫損傷，對移植物起到保護(hù)作用。MICA分子和NKG2D是互為配受體的關(guān)系，且NKG2D是NK細(xì)胞表面

3、的一種激活性受體。但是MICA抗原對內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，sMICA在腎移植中的是否有保護(hù)作用，以及NK細(xì)胞能否被激活而對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，均未見報(bào)道。
　　 因此，本課題將分三個部分進(jìn)行研究：(1)應(yīng)用MICA重組蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察它對內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其分泌功能的影響：(2)外源性抗原對內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及對細(xì)胞上清中sMICA的水平的影響；(3)表達(dá)MICA分子的內(nèi)皮細(xì)胞與N

4、K細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察NK細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分 MICA抗原對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　 目的：觀察主要組織相容性復(fù)合體-I類相關(guān)鏈A(MICA)抗原對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　 方法：將外源性重組MICA蛋白分A5(5ng/ml)，A10(10ng/ml)，A25(25ng/ml)三個劑量加入培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，A0組加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)作

5、為對照組，對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)予以培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期和凋亡情況，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖情況，并測定各組細(xì)胞上清液中前列環(huán)素代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGFlα)、內(nèi)皮素(ET-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI)的水平。
　　 結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組(A5，A10，A25)內(nèi)皮細(xì)胞A570值均高于對照組(A0)。以A5組增殖最為明顯，A10組比A5組稍下

6、降，兩組之間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但明顯高于A25組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。在相同劑量下48h時(shí)增殖率最高，A570值分別為0.458，0.446，0.389。72h和96h呈持續(xù)緩慢增殖，隨著時(shí)間延長增殖率逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。A10，A25組細(xì)胞上清中的6-keto-PGF1α水平分別為144.6，132.8pg/ml，A0，A5組分別為226.5，232.6pg/ml; A10，A25組E

7、T-1水平分別為23.6，25.8pg/ml，A0，A5組分別為11.8，10.4pg/ml。A10，A25組和Ao，A5組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）；而A10與A25組比較，A0與A5組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）。各實(shí)驗(yàn)組(A5，A10，A25)t-PA、PAI分別為161.2，154.2，157.8ng/ml;221.6，248.5，252.4ng/ml;而對照組（A0)分別為233.5ng/ml、137

8、.8ng/ml。實(shí)驗(yàn)組和對照組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞無明顯凋亡，細(xì)胞周期也無明顯改變。
　　 結(jié)論：MICA抗原對內(nèi)皮細(xì)胞的生長周期無明顯影響，也不引起其凋亡，但能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，以小劑量誘導(dǎo)增殖明顯，并呈持續(xù)緩慢增殖。同時(shí)能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，凝血功能增強(qiáng)，而纖溶功能下降，有助于血栓形成。
　　 第二部分外源性抗原對內(nèi)皮細(xì)

9、胞MICA基因表達(dá)的影響
　　 目的：探討外源性抗原對內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因表達(dá)的影響。
　　 方法：將MICA重組蛋白分A5(5ng/ml)，A10(10ng/ml)，A25(25ng/ml)和熱休克蛋白(HSP-70)分B5(5ng/ml)，B10(10ng/ml)，B2s(25ng/ml)各三個劑量的實(shí)驗(yàn)組，對內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)予以誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組A0、B0組分別加等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)。采用實(shí)時(shí)熒光定量P

10、CR方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞MICA mRNA表達(dá)、Western blot法檢測MICA蛋白和流式細(xì)胞儀檢測MICA蛋白在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，用ELISA法測定細(xì)胞上清液中可溶性MICA(sMICA)的水平。
　　 結(jié)果：用三個劑量MICA重組蛋白誘導(dǎo)48h后，各實(shí)驗(yàn)組(A5，A10，A25)內(nèi)皮細(xì)胞MICA mRNA和MICA蛋白的表達(dá)量與對照組比較均有顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。A5組和AIO組MICA mRNA和

11、MICA蛋白均高于A25組，而且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）；但A5組與A10組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MICA膜蛋白表達(dá)以A10組(32.6％)最高，并與A5組(28.2％)、A25組(23.4％)之間有顯著性差異(P<0.05）。各實(shí)驗(yàn)組(A5，A10，A25)sMICA水平分別為35.8、27.4、21.8pg/ml，較對照組(A0，352.5pg/ml)顯著下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），而各

12、實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05）。而HSP蛋白組內(nèi)皮細(xì)胞MICA基因的表達(dá)和sMICA水平無明顯改變。
　　 結(jié)論：外源性MICA抗原能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自身MICA mRNA、總蛋白和膜蛋白表達(dá)上調(diào)，尤其是細(xì)胞膜蛋白增加明顯，但sMICA水平顯著下降，而HSP蛋白組無顯著變化。
　　 第三部分 MICA分子介導(dǎo)NK細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷作用
　　 目的：觀察MICA分子在NK細(xì)胞殺傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中的

13、作用，探討其可能的機(jī)制。
　　 方法：使用免疫磁珠方法及CD56陽性分選試劑盒分選NK細(xì)胞，并將NK細(xì)胞與表達(dá)MICA膜蛋白的活化內(nèi)皮細(xì)胞，共同培養(yǎng)10h。NK細(xì)胞與A0組HUVEC（同第二部分）共培養(yǎng)為A組，與A10組為B組。用熒光素進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察死亡和存活細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算NK細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞殺傷效率，用ELISA法測定細(xì)胞上清中的干擾素-γ(IFN-γ）和穿孔素水平。
　　 結(jié)果：免疫磁珠法可以分選NK細(xì)胞