亞中毒閾劑量毒死蜱腦發(fā)育期暴露對大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的遠(yuǎn)期影響及機(jī)制.pdf

1、帕金森病(Parkinson disease，PD)是全球第二大常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床癥狀以靜止性震顫和運動遲緩等運動障礙為主要表現(xiàn)，可伴有情緒障礙、認(rèn)知障礙甚至癡呆等非運動癥狀。然而，到目前為止，帕金森病的確切病因及發(fā)病機(jī)制并不明確，而流行病學(xué)的調(diào)查顯示環(huán)境因素對占絕大多數(shù)的散發(fā)型PD的發(fā)病具有重要影響。
　　 農(nóng)藥殘余是環(huán)境化學(xué)污染物的重要來源之一，而且我國食品農(nóng)藥殘留超標(biāo)在檢測中長期存在。近期多個媒體報道，存在11

2、種農(nóng)藥殘留超標(biāo)的“毒豆角”竟然從來沒有被檢查過;美國的一項研究發(fā)現(xiàn)，在被調(diào)查人群中高達(dá)82％的人在尿液中檢測到有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphate pesticide，OPs)毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)的代謝產(chǎn)物。毒死蜱是目前全世界范圍使用最廣、用量最大的農(nóng)藥之一，是廣泛用于家庭生活、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及公共衛(wèi)生項目中的一種殺蟲劑和除草劑。因此研究毒死蜱對黑質(zhì)致密部(substantia nigra compact，SNpc

3、)多巴胺(Dopamine，DA)神經(jīng)元的影響及其機(jī)制，有可能為揭示PD的病因及發(fā)病機(jī)制提供新的思路。本研究將從以下五個部分進(jìn)行探索。
　　 第一部分:低劑量毒死蜱對體外多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用
　　 目的: 證實低劑量毒死蜱對多巴胺能神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞的影響。
　　 方法: 在細(xì)胞對數(shù)生長期，對未分化的多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行毒死蜱處理（毒死蜱濃度分別為:10uM、30 uM、50 uM

4、及80 uM），設(shè)立溶媒二甲亞砜（dimethysulfoxide，DMSO）對照組(即濃度為:0 uM);用比色法測定細(xì)胞在暴露毒死蜱后24 h、48 h、72 h及96 hMTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT]水平，檢查細(xì)胞的損傷程度和功能狀況;流式細(xì)胞術(shù)定量地檢測毒死蜱處理后96 h凋亡細(xì)胞百分比;光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　

5、　 結(jié)果: 5種不同濃度毒死蜱處理的多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞直到暴露后96 h都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡;光鏡下也沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;然而，MTT實驗發(fā)現(xiàn):雖然暴露10μM濃度毒死蜱后96 h并未觀察到SH-SY5Y生長受到抑制(p＞0.05)，但在30μM、50μM、80μM毒死蜱濃度暴露后96 h，SH-SY5Y生長受到了明顯抑制(p＜0.05)，同時發(fā)現(xiàn)30μM、50μM和80μM毒死蜱處理組之間沒有明顯差異(p＞0.

6、05)。
　　 結(jié)論: 低劑量毒死蜱暴露多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞雖沒有引起明顯的細(xì)胞凋亡和形態(tài)學(xué)改變，但暴露濃度等于或高于30μM時細(xì)胞的增殖和活力會受到影響。
　　 第二部分:大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型的建立
　　 目的: 建立大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型。
　　 方法: 新生Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)分為CPF組和對照組，對照組又分為DMSO組和生理

7、鹽水(normal sodium，NS)組。在大鼠出生后11-14 d(postnatal day11-14，PND11-14)經(jīng)腹部皮下注射亞中毒閾劑量（5 mg/kg.d）毒死蜱，建立大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型;將脂溶性的毒死蜱溶于溶媒DMSO中處理大鼠;對照組分別以DMSO、NS替代毒死蜱。每次給藥后12h嚴(yán)密觀察有無抽搐、急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒癥狀以及翻正反射改變情況;并在PND20、PND30和PND60三個時間點

8、，觀察大鼠體重增長、腦外觀、腦系數(shù)和腦含水量變化。
　　 結(jié)果: 大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱后未觀察到急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒癥狀，觀察至青春期(PND30)及成年期(PND60)均未發(fā)現(xiàn)其體重增長、腦外觀、腦系數(shù)、腦含水量明顯異常。
　　 結(jié)論: SD大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型建立成功，亞中毒閾劑量毒死蜱短期暴露易被認(rèn)為是“安全的”，并容易被忽視。
　　 第三部分:亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育

9、期暴露對中腦黑質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及多巴胺能神經(jīng)元動態(tài)的影響
　　 目的: 探索亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育期暴露對中腦黑質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元動態(tài)的影響。
　　 方法: 新生SD大鼠，隨機(jī)分為CPF組和對照組（DMSO組、NS組），建立大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型。在PND20、PND30和PND60用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物酪氨酸羥

10、化酶(tyrosine hydroxylase，TH)表達(dá)情況，通過免疫透射電鏡觀察黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化;在毒死蜱暴露后12h、24 h、72 h以及PND30、PND60用免疫組織化學(xué)法半定量檢測黑質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD11b的表達(dá)的變化，通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測中腦黑質(zhì)中TH分別與GFAP、CD11b的表達(dá)情

11、況。
　　 結(jié)果: ①，大鼠腦發(fā)育期(PND11-14)暴露亞中毒閾劑量毒死蜱后，雖然在PND20時中腦黑質(zhì)沒有顯著的多巴胺能神經(jīng)元的丟失，但在青春期時(PND30) CPF組大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元較對照組出現(xiàn)明顯的丟失(p＜0.05)，并隨著年齡的增長，到成年期時(PND60) CPF組大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元呈進(jìn)行性丟失趨勢(p＜0.05)。透射電鏡觀察到成年期CPF組大鼠黑質(zhì)存活的部分多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變。②.大

12、鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱能迅速誘導(dǎo)黑質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活，其中小膠質(zhì)細(xì)胞激活早于星型膠質(zhì)細(xì)胞，在暴露后12 h就開始明顯活化，但到青春期時就基本恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài);星型膠質(zhì)細(xì)胞的明顯活化比小膠質(zhì)細(xì)胞的活化持久，一直到成年期。
　　 結(jié)論: 大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱能迅速激活黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞，并誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元遲發(fā)性進(jìn)行性損傷。
　　 第四部分:亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育期暴

13、露對中腦黑質(zhì)p38MAPK、NFκB p65信號途徑的影響
　　 目的: 探討亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育期暴露對中腦黑質(zhì)部位重要的炎癥信號途徑p38MAPK、NFκp65的影響。
　　 方法: 新生SD大鼠，隨機(jī)分為CPF組、DMSO組和NS組，每組又分為毒死蜱暴露后12h、24 h、72 h三個亞組。建立大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型。利用免疫組織化學(xué)方法觀察中腦黑質(zhì)磷酸化p38MAPK表達(dá)及核染情況，N

14、FκB p65活化后核移位情況;并用Western-blotting法定量檢測中腦黑質(zhì)腦組織勻漿中p-p38MAPK、p-NFκB p65和NFκB p65的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果: 從毒死蜱暴露后12 h開始，CPF組大鼠中腦黑質(zhì)中可以觀察到磷酸化p38MAPK陽性免疫復(fù)合物的大量表達(dá)，表達(dá)水平在三個時點均較對照組增高，棕黃色的核染顏色較對照組深，核染數(shù)目較對照組多，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，并在毒死蜱暴露后24

15、h即達(dá)到了表達(dá)高峰，并持續(xù)高表達(dá)到毒死蜱暴露后72 h，Western-blotting法檢測到黑質(zhì)p-p38MAPK表達(dá)水平變化和免疫組化結(jié)果一致;同樣可以觀察到黑質(zhì)NFκB p65的核移位表達(dá)增加，Western-blotting法檢測發(fā)現(xiàn)p-NFκB p65表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)，并在毒死蜱暴露后72h達(dá)到高峰，但不影響總的NFκBp65的表達(dá)(p＞0.05)。
　　 結(jié)論: 大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱能迅速導(dǎo)致

16、炎癥信號通路p38MAPK及NFκB p65信號途徑的活化，黑質(zhì)部位炎性環(huán)境可能參與了多巴胺能神經(jīng)元的遲發(fā)進(jìn)行性損傷。
　　 第五部分:大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱對其青春期及成年期運動能力和學(xué)習(xí)記憶的影響
　　 目的: 探索亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育期暴露對大鼠遠(yuǎn)期整體神經(jīng)行為的影響。
　　 方法: 新生SD大鼠，隨機(jī)分為CPF組、DMSO組和NS組。建立大鼠腦發(fā)育期暴露亞中毒閾劑量毒死蜱動物模型。在大

17、鼠成長至青春期(PND30)及成年期(PND60)時，用空場實驗、懸吊實驗和斜坡實驗評估大鼠主動運動功能和運動協(xié)調(diào)能力的變化，通過Mirros水迷宮法評價其空間學(xué)習(xí)和記憶提取能力的改變。
　　 結(jié)果: 曠場實驗中青春期的各組大鼠垂直次數(shù)、修飾次數(shù)及大便顆粒數(shù)無顯著差異(p＞0.05)，但CPF組大鼠移動總格數(shù)及中央格停留時間顯著少于對照組(p＜0.05)，成年期CPF組大鼠的移動總格數(shù)和中央格停留時間進(jìn)一步減少，垂直次數(shù)、修飾次

18、數(shù)和大便顆粒數(shù)亦顯著少于DMSO和NS組別(p＜0.05)，與青春期CPF組相比亦有顯著性差異(p＜0.05);懸吊實驗和斜坡實驗中，青春期各組大鼠表現(xiàn)無差別，直到成年期才發(fā)現(xiàn)CPF組能抓住繩子維持的時間較對照組明顯縮短、從斜坡上滑下次數(shù)較對照組明顯增加(p＜0.05); Morris水迷宮實驗中CPF組青春期大鼠在定位航行實驗中到達(dá)平臺的逃避潛伏期雖然長于同時期DMSO組和NS組，在空間探索實驗中大鼠在目標(biāo)象限停留距離稍縮短，但結(jié)果較

19、對照組都無顯著差異(p＞0.05)，到成年期時，CPF組大鼠到達(dá)平臺的逃避潛伏期明顯長于同時期對照組大鼠(p＜0.05)，且空間探索實驗中發(fā)現(xiàn)CPF組大鼠的搜索軌跡多集中在原來的起始象限或相鄰象限，且CPF組成年期大鼠在目標(biāo)象限停留距離進(jìn)一步縮短，并和對照組比較存在顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論: 亞中毒閾劑量毒死蜱大鼠腦發(fā)育期暴露能導(dǎo)致大鼠出生后遠(yuǎn)期整體行為的改變，主要表現(xiàn)為大鼠在青春期和成年期開始出現(xiàn)了主動運動能力