大鼠顳葉癲癇中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化及其意義.pdf

1、研究背景癲癇(epilepsy)是由多種病因引起的慢性腦部疾患，以腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。根據(jù)所侵犯神經(jīng)元的部位和放電擴散的范圍，功能失常又表現(xiàn)為運動、感覺、意識、行為、自主神經(jīng)功能等不同障礙，或兼而有之。癲癇是一種常見病，全世界發(fā)病率為35/10萬·年，患病率為0.5％。在我國每年有45萬新增癲癇病人，癲癇病人總數(shù)約650萬。 既往研究發(fā)現(xiàn)癲癇病人腦脊液(cerebrospinal

2、fluid，CSF)內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(homovanillicacid，HVA)含量降低，抗癇治療好轉(zhuǎn)后，其含量可有所升高。直接測定癲癇病人大腦皮質(zhì)病灶切除部的單胺類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)病灶內(nèi)DA含量較周圍組織顯著降低，說明DA參與了癲癇的發(fā)生和傳導(dǎo)過程，多巴胺能神經(jīng)元活性降低可能是癲癇發(fā)生發(fā)展的重要因素。以往研究主要集中于下丘及紋狀體中，而黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元在癲癇中的變化及意義目前尚不清楚。 多巴胺

3、的不同作用是由特異的受體來介導(dǎo)，多巴胺受體分為D1與D2兩個亞群。現(xiàn)有報到D1類受體的存在使興奮性氨基酸如谷氨酸的神經(jīng)毒性加強，使抑制性氨基酸如γ-氨基丁酸(GABA)濃度降低，同時，可能通過鈣離子的內(nèi)流增加，使動作電位后出現(xiàn)持續(xù)性去極化狀態(tài)，從而使癲癇活動得以加強；D2類受體的興奮拮抗興奮性氨基酸及毒蕈堿所致的興奮性神經(jīng)毒性，從而降低癲癇的發(fā)生機率。但是各部位腦區(qū)內(nèi)所含兩類受體的多少及傳導(dǎo)通路的不同，使各部位在癲癇傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)中表現(xiàn)不同

4、。黑質(zhì)-紋狀體通道(nigrostriatalpathway)主要起源于黑質(zhì)，有一小束起源于黑質(zhì)鄰近的腹側(cè)被蓋區(qū)(ventertegmentalarea，VTA)，主要投射到尾狀核與豆狀核。此處為顱內(nèi)多巴胺與多巴胺受體的高密區(qū)，含有整個大腦多巴胺含量的80％以上，在其中黑質(zhì)起到“公共閘門”的調(diào)控作用。但黑質(zhì)中多巴胺受體是否參與顳葉癲癇的調(diào)節(jié)，以及該部位中各多巴胺受體亞型在顳葉癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用目前不明確。 本課題擬通過免疫組織

5、技術(shù)，半定量檢測黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變化，利用多巴胺受體拮抗劑模擬多巴胺神經(jīng)元含量減少，使多巴胺受體興奮性下降，試圖探討黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化在顳葉發(fā)生發(fā)展中的作用。 第一章顳葉癲癇模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化的實驗研究目的建立大鼠顳葉癲癇模型，觀察癲癇不同時段內(nèi)大鼠行為學(xué)及腦電圖變化，研究顳葉癲癇模型中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的改變，探討其相互關(guān)系。 方法取SD大鼠43只，設(shè)正常對照組，生理鹽水組，紅藻氨酸致癇組(KA組)。生

6、理鹽水組及KA組大鼠于右側(cè)側(cè)腦室分別注射生理鹽水(2uL)和紅藻氨酸(5ug)，正常對照組不予任何處理。給藥后觀察各時段動物行為及腦電圖改變，于第0.5h，2h，12h，24h和3d將動物處死，取黑質(zhì)部切片作免疫組織化學(xué)檢測，記錄陽性細胞數(shù)作半定量分析，并與腦電圖波幅變化作相關(guān)性分析。 結(jié)果正常對照組及生理鹽水組無癲癇發(fā)作。紅藻氨酸致癇組大鼠均出現(xiàn)癲癇發(fā)作，發(fā)作于腦室注射紅藻氨酸后10min開始，1h達高峰，3-6h后停止。根據(jù)

7、Racine癲癇行為分級，KA組動物達到四級或五級，符合癲癇模型要求。注射前、后空正常對照組及生理鹽水組無尖波、棘波、棘慢綜合波等癇性電活動表現(xiàn)。KA組于注射后10min即有癇性波出現(xiàn)，其波為尖波、棘波，頻率較高；1h左右癲癇發(fā)作達高峰時癇性波大部為高幅的尖波、棘波，出現(xiàn)頻率更高；3～6h后癇性波降低，12h后無癇性波出現(xiàn)。從各時段內(nèi)大鼠腦電圖中隨機取3分鐘作波幅統(tǒng)計。正常對照組、生理鹽水組各時段波幅無明顯變化；KA組各時段波幅有明顯差

8、別，注射前為1.449±0.205mV，以后逐漸上升，到2小時達到最大值3.877±0.165mV，以后又漸下降，各時間段波幅值用one-wayANOVA分析，F(xiàn)=47.396，p=0.000，各時間段波幅有顯著性差異。癲癇發(fā)作后0.5h開始伴隨有黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元陽性細胞數(shù)減少，與生理鹽水組相比其差值有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.003)，2-6h持續(xù)下降，3d后細胞數(shù)接近正常，與生理鹽水組相比其差值沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。

9、結(jié)論一側(cè)側(cè)腦室注入紅藻氨酸，可成功建立癲癇模型。紅藻氨酸致癇后伴有黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元細胞數(shù)的下降，其細胞數(shù)下降與癲癇電生理改變存在明確的相關(guān)性，說明黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元參與了顳葉癲癇活動的調(diào)節(jié)。 第二章黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元在顳葉癲癇中的作用 目的建立顳葉癲癇模型，通過黑質(zhì)內(nèi)給予多巴胺D1受體拮抗劑SCH23390及D2受體拮抗劑Haloperidol對癲癇的影響，確定黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化在顳葉癲癇中的作用。 方法取SD

10、大鼠30只，設(shè)生理鹽水組，紅藻氨酸組(KA組)，SCH23390組，Haloperidol組，生理鹽水+KA組。生理鹽水組及KA組大鼠于右側(cè)側(cè)腦室分別注射生理鹽水(2mL)和紅藻氨酸(5ug)，SCH2339組、Haloperidol組、生理鹽水+KA組在右側(cè)黑質(zhì)內(nèi)分別注射SCH23390、Haloperidol、生理鹽水各1uL，30min后于右側(cè)腦室注射KA(5ug)致癇，觀察各組間的大鼠行為變化及腦電圖變化。5天后處死大鼠，根據(jù)大

11、鼠圖譜取海馬部切片作TUNEL染色，觀察海馬部神經(jīng)細胞凋亡情況。 結(jié)果1.生理鹽水組無癲癇發(fā)作。KA組大鼠均出現(xiàn)癲癇發(fā)作，發(fā)作于腦室注射紅藻氨酸后10分鐘開始，1小時達高峰，3-6h后停止。癲癇發(fā)作后伴隨有海馬細胞的凋亡，3～5天明顯。黑質(zhì)內(nèi)給予SCH23390后，動物行為及腦電圖改變不明顯，海馬部凋亡細胞無明顯減輕，與KA組相比其差值無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；給予Haloperidol后，腦電圖平均波幅增高，海馬部凋亡細胞