新生鼠暴露低劑量毒死蜱后對脂多糖所致免疫反應(yīng)的影響.pdf

1、農(nóng)藥污染是環(huán)境污染的重要構(gòu)成之一,有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱是全世界使用最廣泛的農(nóng)藥之一。近年來有研究發(fā)現(xiàn)短期暴露于一定劑量毒死蜱,不會抑制乙酰膽堿酯酶的活性,但可引起大鼠T淋巴細(xì)胞功能受損。我們前期研究顯示,SD新生鼠在膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育高峰期(出生后11～14天)暴露低劑量毒死蜱可誘導(dǎo)中腦黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化并導(dǎo)致中腦TNF-α表達(dá)上調(diào)。兒童對于環(huán)境有害因素較成人更為易感,相同的暴露對兒童會產(chǎn)生更嚴(yán)重而持久的損害,特別是對發(fā)育中的腦組織可能造成嚴(yán)重的

2、甚至是永久性損害。因此,積極研究毒死蜱等環(huán)境化學(xué)污染物對兒童生長發(fā)育腦的影響及相關(guān)機(jī)制,有望為防治兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供思路,并為制定農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。
　　 免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。T淋巴細(xì)胞是具有多功能的細(xì)胞群體,CD4+和CD8+是成熟T淋巴細(xì)胞不同亞群的表面標(biāo)志,代表兩類重要的細(xì)胞亞群。CD4+為輔助性T淋巴細(xì)胞,能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的增殖和分化,協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相互作用;

3、CD8+為抑制性T淋巴細(xì)胞,可抑制免疫應(yīng)答活化期。在正常情況下,CD4+與CD8+保持一定的比例,二者之間相互誘導(dǎo),相互制約,其數(shù)目異?；虮壤怪?均可導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能紊亂和免疫失調(diào)。
　　 補(bǔ)體是免疫分子重要的組成部分,是存在于血清和組織液中一組具有酶活性的蛋白質(zhì),由30多種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白組成。它廣泛參與機(jī)體抗微生物的免疫反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、免疫損傷以及移植排異等。C4d是補(bǔ)體C4的片段,參與補(bǔ)體經(jīng)典途徑的激活。
　

4、　 星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦中數(shù)量最多的細(xì)胞,在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。S100 Calcium-bingding proein Beta(以下簡稱S100B蛋白)是腦膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要集中星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),可作為心肺復(fù)蘇后及宮內(nèi)生長遲緩新生兒神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)的預(yù)測指標(biāo)。
　　 免疫激發(fā)狀態(tài)是指機(jī)體受外界刺激所激發(fā)的機(jī)體免疫反應(yīng)的狀態(tài),免疫激發(fā)是免疫反應(yīng)的初始環(huán)節(jié)。脂多糖是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分,具有多種生

5、物學(xué)活性和免疫學(xué)特性,對機(jī)體有很強(qiáng)的毒性和抗原性。當(dāng)機(jī)體受到脂多糖刺激,可直接或間接激活細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子可激活補(bǔ)體,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,在疾病發(fā)生中介導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,常作為免疫刺激劑來模擬機(jī)體免疫應(yīng)激狀態(tài)。體外實驗研究發(fā)現(xiàn),有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱代謝物聯(lián)合脂多糖可致IFN-Y表達(dá)增加,但低劑量毒死蜱基礎(chǔ)上對脂多糖致新生鼠腦組織及全身免疫系統(tǒng)改變的研究尚無文獻(xiàn)報導(dǎo)。在本實驗中,我們以新生鼠為研究對象,建立脂多

6、糖致新生鼠免疫激發(fā)狀態(tài)動物模型,參考課題組前期實驗方法建立暴露低劑量毒死蜱模型,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+變化,免疫組織化學(xué)檢測中腦黑質(zhì)C4d的表達(dá),免疫組織化學(xué)和WesternBlotting方法檢測中腦黑質(zhì)S100B蛋白的表達(dá),研究SD新生鼠在暴露低劑量毒死蜱基礎(chǔ)上對脂多糖所致免疫反應(yīng)的影響。
　　 一、脂多糖致新生鼠免疫激發(fā)狀態(tài)動物模型的建立
　　 目的:建立一種簡單可靠的模擬機(jī)體免疫

7、激發(fā)狀態(tài)的動物模型。
　　 方法:出生11天SD大鼠36只,隨機(jī)分為生理鹽水對照組(n=18)及脂多糖實驗組(n=18)。實驗組于生后第15天腹腔注射一次1mg/ml的脂多糖,給藥體積為1ml/kg,生理鹽水對照組予等體積生理鹽水代替。建立模型后6h、30h、54h分別在相應(yīng)時間點處死。實驗取材時3個時間點兩組大鼠均制備腦組織石蠟切片行中腦黑質(zhì)C4d免疫組織化學(xué)檢測,其中6h時間點兩組大鼠在生理鹽水灌注前先予心臟采血用于流式細(xì)胞

8、術(shù)分析。以注射脂多糖后6h是否引起外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及54h內(nèi)中腦補(bǔ)體C4d變化判斷模型建立成功與否。
　　 結(jié)果:①外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+:實驗組外周血CD4+細(xì)胞數(shù)值較對照組減少,CD8+細(xì)胞數(shù)值較對照組增加,CD4+/CD8+細(xì)胞比值較對照組下降(P＜0.05);②中腦黑質(zhì)C4d:6h、30h不表達(dá),54h實驗組表達(dá)較對照組明顯增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:脂多糖可誘導(dǎo)致新

9、生鼠免疫激發(fā)狀態(tài),表現(xiàn)為外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+細(xì)胞數(shù)值減少,CD8+細(xì)胞數(shù)值增加,CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降;中腦補(bǔ)體C4d表達(dá)增加。建立了一種簡單可靠的由脂多糖誘導(dǎo)的免疫激發(fā)狀態(tài)的動物模型。
　　 二、毒死蜱對脂多糖致新生鼠外周血CD4+、CD8+及中腦C4d、S100B蛋白表達(dá)的影響
　　 目的:觀察SD新生鼠在暴露低劑量毒死蜱基礎(chǔ)上對脂多糖致外周血CD4+、CD8+及中腦C4d、S100B蛋白表達(dá)的影響。

10、
　　 方法:出生11天SD大鼠180只,隨機(jī)分為對照組(n=72)及實驗組(n=108),對照組又分為生理鹽水組、二甲基亞砜組,實驗組分為毒死蜱組、脂多糖組、毒死蜱加脂多糖組。毒死蜱組、毒死蜱加脂多糖組從大鼠出生11天起,經(jīng)腹部皮下注射毒死蜱(溶解于二甲基亞砜中,濃度為5mg/ml),給藥體積為1ml/kg,每天一次,連續(xù)注射4天,建立暴露低劑量毒死蜱SD新生鼠動物模型。對照組二甲基亞砜組和生理鹽水組分別予等體積二甲基亞砜和生

11、理鹽水代替。毒死蜱加脂多糖組注射毒死蜱后18h按第一部分方法建立脂多糖動物模型,脂多糖組在生后15天按第一部分方法建立脂多糖動物模型。對照組二甲基亞砜組、生理鹽水組分別予等體積生理鹽水代替。建立脂多糖模型后6h、30h、54h分別在相應(yīng)時間點處死。實驗取材時每組動物每個時間點取腦用于中腦C4d、S100B蛋白免疫組織化學(xué)方法及中腦S100B蛋白Westem-blotting方法檢測;其中6h時間點各組大鼠在生理鹽水灌注前先予心臟采血用于

12、流式細(xì)胞術(shù)分析。實驗動物注射毒死蜱后嚴(yán)密觀察12h是否有急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒癥狀(如抽搐、震顫、流涎、呼吸抑制、死亡等)。
　　 結(jié)果:①注射毒死蜱后未見急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒癥狀。②外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+:毒死蜱組外周血CD4+細(xì)胞數(shù)值較對照組減少,CD8+細(xì)胞數(shù)值較對照組增加,CD4+/CD8+細(xì)胞比值較對照組下降(P＜0.05);毒死蜱加脂多糖組外周血CD4+細(xì)胞數(shù)值較對照組減少,CD8+細(xì)胞數(shù)值較對照組增加,C

13、D4+/CD8+細(xì)胞比值較對照組下降(P＜0.05);毒死蜱加脂多糖組CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)值較單獨脂多糖組明顯減少,CD4+/CD8+細(xì)胞比值較單獨脂多糖組明顯下降(P＜0.05);二甲基亞砜組外周血CD4+細(xì)胞數(shù)值、CD8+細(xì)胞數(shù)值、CD4+/CD8+細(xì)胞比值與生理鹽水組比較,P＞0.05。③中腦黑質(zhì)C4d:6h、30h不表達(dá),54h毒死蜱組表達(dá)較對照組明顯增加;毒死蜱加脂多糖組表達(dá)較對照組明顯增加,較單獨脂多糖組明顯減少(P＜0

14、.05);二甲基亞砜組C4d表達(dá)與生理鹽水組比較,P＞0.05。④中腦黑質(zhì)S100B蛋白:毒死蜱組表達(dá)較對照組明顯增加,脂多糖組表達(dá)較生理鹽水對照組明顯增加,毒死蜱加脂多糖組表達(dá)較對照組明顯增加,較單獨脂多糖組明顯減少(P＜0.05)。各實驗組S100B蛋白各自在3個時間點比較,呈時間依賴性增加(P＜0.05);各時間點二甲基亞砜組S100B蛋白與生理鹽水組比較,P＞0.05。
　　 結(jié)論:①低劑量毒死蜱可減弱SD新生鼠對脂多糖