貫葉金絲桃素衍生物對淀粉樣前體蛋白水解途徑的影響.pdf

1、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease，AD)是以進行性認知和記憶減退為特征的神經退行性疾病。其發(fā)病原因和機制到目前為止尚未闡明，目前較公認的淀粉樣級聯假說認為β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)是AD的一個關鍵起始因素，Aβ的過度聚集可以引發(fā)一系列的神經毒性，并最終導致AD發(fā)生。而Aβ是淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)水解代謝產物。當前藥物研發(fā)的熱點之一

2、便是尋找能夠抑制Aβ產生的藥物。
　　 貫葉金絲桃素(Hyperforin，HF)是貫葉連翹(Hypericum perforatum L.)提取物中的有效成分之一，是目前天然植物的研究熱點。有研究表明HF能夠減少Aβ的神經毒性以及改善記憶認知功能，但其對APP具體水解調控及機制還缺乏深入研究。HF對光，熱，氧氣極為敏感，常溫下極易氧化，其不對穩(wěn)定性對其深入研究和藥用開發(fā)造成了一定困難。因此以HF為先導化合物進行結構修飾與改造，

3、得到化學結構穩(wěn)定，毒副作用小的抗AD藥物具有重要的應用價值。
　　 貫葉金絲桃素乙酸酯(hyperforin acetate，Ac-HF)和八氫貫葉金絲桃素乙酸酯(octahydrohyperforin acetate，(8H)-Ac-HF)是貫葉金絲桃素的脂溶性衍生物，具有比原型更為穩(wěn)定的理化性質。本實驗室前期研究發(fā)現，Ac-HF在神經母瘤細胞SH-SY5Y中能夠調節(jié)APP代謝，增加sAPPα的生成，但其在神經元細胞中的作用及

4、其具體機制還需要進一步探討，同時(8H)-Ac-HF的藥理作用及機制也未見任何報道。
　　 目的：探討Ac-HF和(8H)-Ac-HF對皮層原代神經元細胞中APP水解調控的影響及其作用機制。
　　 方法：建立SD大鼠皮層原代神經元細胞體外培養(yǎng)體系，通過MTT實驗檢測Ac-HF和(8H)-Ac-HF對原代神經元細胞的生長活力影響；利用ELSIA技術檢測Ac-HF和(8H)-Ac-HF對原代神經元細胞培養(yǎng)上清液sAPPα分泌

5、的影響；采用Western blot技術檢測藥物對APP及其水解途徑重要蛋白BACE1，ADAM10表達的影響；同時檢測藥物對α-泌酶活性的影響；通過蛋白激酶C抑制劑CalphostinC(Cal.C)觀察兩種藥物可能作用的信號靶點。
　　 結果：MTT結果顯示：0-10μmol/L Ac-HF和0-50μmol/L(8H)-Ac-HF處理皮層神經元30h對細胞生長活性并沒有影響；ELSIA結果顯示Ac-HF和(8H)-Ac-H

6、F可以促進神經元細胞sAPPα的胞外分泌水平，并且呈現出時間和濃度相關性。并且10μmol/L Ac-HF在18 h，50μmol/L的(8H)-Ac-HF在24 h對于神經元細胞sAPPα的促分泌作用效果最為明顯，與對照組相比，sAPPα分別增加至1.9倍(P＜0.01)和2.5倍(P＜0.01)。Western blot結果表明Ac-HF和(8H)-Ac-HF可以上調ADAM10表達，但對APP和BACE1的表達沒有顯著性影響；α-

7、分泌酶活性檢測結果表明10μmol/L Ac-HF和50μmol/L(8H)-Ac-HF在24h可使神經元細胞中的α-分泌酶活性分別增加至1.36倍(P＜0.01)和1.53倍(P＜0.01)；在作用機理的研究中，0.5μmol/L蛋白激酶C(PKC)抑制劑Calphostin C(Cal.C)預處理細胞2 h后可阻斷兩種藥物對sAPPα、ADAM10和α-分泌酶的上調作用。
　　 結論：本研究在建立皮層神經元原代培養(yǎng)技術的基礎

8、上，檢測了兩種HF衍生物對APP水解途徑的影響。Ac-HF和(8H)-Ac-HF可有效增加α-分泌酶的活性，使APP更多地經非淀粉樣途徑水解，并能夠增加具有神經營養(yǎng)作用的sAPPα的胞外分泌水平。進一步研究表明，其作用是通過PKC介導，調節(jié)APP加工，增強α-分泌酶的活性，增加ADAM10表達，進而使APP通過非Aβ途徑水解，既減少了Aβ的神經毒性，又促進了具有神經營養(yǎng)作用的sAPPα的分泌。實驗證據表明Ac-HF和(8H)-Ac-HF