MiRNA-26a對(duì)大鼠心臟重構(gòu)的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　心臟重構(gòu)在近年來(lái)被國(guó)內(nèi)外研究者認(rèn)為是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的根本原因之一，心臟重構(gòu)是由包括心臟成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同參與、通過(guò)一系列復(fù)雜的分子途徑和細(xì)胞激活所誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程。心臟重構(gòu)的病理形態(tài)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，其中心肌間質(zhì)纖維化可以通過(guò)限制心肌細(xì)胞活動(dòng)，增加心肌僵硬度，從而降低心室順應(yīng)性，影響心肌的收縮和舒張功能。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約19-23個(gè)堿基的單鏈

2、非編碼 RNA分子，通過(guò)與靶基因的結(jié)合，抑制或降解靶基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的負(fù)調(diào)控。大量研究證實(shí)miR-26a在心臟重構(gòu)動(dòng)物模型心肌組織中的表達(dá)下調(diào)，結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析，TGF-β-smads相關(guān)通路很可能是miR-26a的靶目標(biāo)之一，而TGF-β-smads相關(guān)通路是心臟重構(gòu)、心衰發(fā)病過(guò)程中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，miR-26a可能會(huì)通過(guò)調(diào)控TGF-β-smads相關(guān)通路的表達(dá)，進(jìn)而影響心臟重構(gòu)。為此，我們通過(guò)建立心臟重構(gòu)大鼠

3、動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，研究miRNA-26a對(duì)TGF-β-smads蛋白及其相關(guān)通路和膠原代謝的調(diào)控作用，以明確在心衰、心臟間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用蛋白的表達(dá)，從而基于該蛋白設(shè)計(jì)其特異性的miRNA的分子藥物以調(diào)控該特異蛋白的表達(dá)，從而在心臟重塑過(guò)程中對(duì)膠原的代謝起調(diào)控作用，miRNA及其下游特異性的靶蛋白和膠原代謝相關(guān)性的研究將為心肌重塑提供新的研究方向，建立起全新的針對(duì)心衰的治療靶點(diǎn)，對(duì)于心血管疾病治療的臨床應(yīng)用具有重大的指

4、導(dǎo)意義。
　　一、研究目的：
　　1.探索 miR-26a在大鼠心臟重構(gòu)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中的可能角色；
　　2.通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，了解 miR-26a、TGF-β-smads相關(guān)通路蛋白和心臟重構(gòu)三者之間的關(guān)系。
　　二、研究?jī)?nèi)容：
　　1.手術(shù)制備大鼠心臟肥厚模型并心臟超聲檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)和功能，以驗(yàn)證動(dòng)物模型；
　　2.采用QRT-PCR(Real time Quantitative PCR實(shí)時(shí)熒光定量

5、PCR)連續(xù)檢測(cè)大鼠動(dòng)物模型制備過(guò)程中血漿miRNA-26a的表達(dá)變化；
　　3.細(xì)胞水平研究miRNA-26a對(duì)RCF(Rat Cardiac Fibroblasts大鼠心臟成纖維細(xì)胞)膠原合成的影響，并驗(yàn)證其可能作用位點(diǎn)TGF-β、Smads相應(yīng)mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。
　　三、研究方法：
　　1.腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠壓力過(guò)負(fù)荷心臟重構(gòu)模型，用動(dòng)物心臟彩超、病理組織切片染色等方法證實(shí)壓力過(guò)負(fù)荷心臟重構(gòu)模型建

6、立成功。
　　2. QRT-PCR法連續(xù)檢測(cè)TAAC（Transverse Abdominal Aortic Constrition腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)）組及Sham（假手術(shù)）組大鼠血漿 miR-26a的表達(dá)水平。
　　3.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics（擬似物）和inhibitor（抑制劑）及其各自NC(陰性對(duì)照)后，研究miRNA-26a通過(guò)靶向TGF-β、smads蛋白通路調(diào)節(jié)膠原合成的功能。QRT-PCR法檢測(cè)各

7、組miR-26a的表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)I型、III型膠原蛋白量的變化，QRT-PCR檢測(cè)各組間I型、III型膠原蛋白mRNA水平的變化；并Western blot方法檢測(cè)TGF-β及smads通路相關(guān)蛋白的變化（TGF-β1、smad4、smad7），QRT-PCR檢測(cè)各組TGF-β及smads通路蛋白的mRNA的改變（TGF-β1、smad4、smad7）。
　　四、結(jié)果：
　　1.用 TAAC法成功建立

8、大鼠壓力過(guò)負(fù)荷心臟重構(gòu)模型；
　　2.TAAC心臟重構(gòu)大鼠血漿中 miR-26a的水平與對(duì)照組（Sham）相比，第二周開(kāi)始下調(diào)，第三周達(dá)到高峰，之后處于穩(wěn)定水平但較對(duì)照組及術(shù)前仍有所下降（P﹤0.01）；
　　3.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics后，miR-26a表達(dá)量較其陰性對(duì)照組明顯升高（P﹤0.01）；轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，miR-26a的表達(dá)量較其陰性對(duì)照組明顯下降（P﹤0.01）；

9、r>　　4.RCF轉(zhuǎn)染 miR-26a mimics后，TGF-β1、smad4 mRNA的表達(dá)量減少（P﹤0.01），TGF-β1、smad4的蛋白表達(dá)量減少（P﹤0.01），而轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，TGF-β1、smad4 mRNA的表達(dá)量增多（P﹤0.01），TGF-β1、smad4的蛋白表達(dá)量增多（P﹤0.01）；而smad7 mRNA及蛋白水平表達(dá)均未見(jiàn)明顯差異（P>0.05）。
　　5.RCF轉(zhuǎn)染

10、 miR-26a mimics后，I型、III型膠原mRNA及蛋白表達(dá)增加（P﹤0.01），而轉(zhuǎn)染 miR-26a inhibitor后，I型、III型膠原mRNA及蛋白表達(dá)減少（P﹤0.01）。
　　五、結(jié)論：
　　1. miR-26a在大鼠心臟重構(gòu)模型中表達(dá)下調(diào)且發(fā)生在心臟重構(gòu)之前，對(duì)于臨床心衰或心肌重構(gòu)可能具有早期診斷意義。
　　2. miR-26a可能通過(guò)作用于靶點(diǎn)TGF-β-smads相關(guān)通路蛋白調(diào)控心臟重構(gòu)