急性低溫暴露對大鼠肝臟的損傷及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　寒冷地區(qū)的冬季，人們在戶外活動時會暴露于低溫環(huán)境中。從事低溫環(huán)境作業(yè)的人員和參加特殊環(huán)境軍事活動的官兵也經(jīng)常暴露于低溫環(huán)境中。低溫環(huán)境對機體的影響和如何預防低溫暴露相關疾病一直是人們研究的熱點，具有重要意義。
　　低溫環(huán)境對人體造成損傷的機制以其特殊的軍事地位和作用，很少有相關內(nèi)容的公開報道。目前，人們對于低溫環(huán)境對機體損傷機制的研究多限于長期的慢性暴露模型，而急性的低溫暴露模型尚未見到相關的報道。在北方高寒

2、地區(qū)冬季，部隊執(zhí)行野外巡邏和站崗任務的士兵需要暴露在寒冷環(huán)境中，如果防護措施不當則很容易造成急性凍傷。目前，對于急性寒冷損傷的研究多集中在體表皮膚及肌肉組織的凍傷，而體內(nèi)臟器在急性低溫暴露時受到的影響及其發(fā)揮的作用尚未見到相關報道。人體暴露于低溫環(huán)境后，需要動員產(chǎn)熱以維持體溫。雖然在此時肌肉的寒顫產(chǎn)熱占主導作用，但肝臟作為體內(nèi)最大的糖原儲存器官和靜息狀態(tài)的主要產(chǎn)熱器官，也可能參與到急性低溫暴露下機體的應激過程中。在大鼠和人的正常生長過程

3、中，肝臟可以形成一定數(shù)量的雙核細胞，雙核細胞的形成可能與肝臟損傷和增殖能力相關。在能量缺乏或其他損傷效應作用下，肝細胞有絲分裂失敗而形成雙核細胞。PI3K-Akt-mTOR通路是重要的生存信號通路，參與細胞的能量代謝，增殖分化，生長繁殖等重要過程。其在低溫暴露過程中起到的作用已在慢性模型中進行相關研究，但在急性低溫暴露模型中及在肝臟中的相關作用尚未闡明。
　　本研究試圖通過建立急性低溫暴露模型，探討急性低溫暴露是否可以引起肝臟病理

4、生理學改變，并探討PI3K-Akt-mTOR通路是否參與了急性低溫暴露過程中的應答過程及其調控機制，為探索更多的低溫暴露效應標志物及預防靶點提供理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.在大鼠急性低溫暴露模型中，研究急性低溫暴露引起大鼠肝臟的病理生理學改變，觀察肝臟有絲分裂細胞及雙核細胞在低溫暴露過程中數(shù)量的變化及細胞能量水平的變化。同時觀察PI3K-Akt-mTOR通路的變化情況及其與肝臟病理生理改變的關系。
　　2.通過

5、使用通路抑制劑，觀察PI3K-Akt-mTOR通路與肝細胞能量水平變化的關系及其是否參與了肝細胞有絲分裂增加及雙核細胞形成的過程。
　　研究方法:
　　1.利用低溫實驗艙，建立大鼠急性低溫暴露模型：暴露溫度為﹣15℃，暴露時間為0.5h、1h、2h和4h。
　　2.利用組化方法，通過HE染色觀察急性低溫暴露后大鼠肝臟的損傷情況及雙核細胞的形成。
　　3.利用電鏡，觀察急性低溫暴露對大鼠肝臟超微結構的影響。

6、　　4.利用western blot方法，觀察PI3K-Akt-mTOR通路在急性低溫暴露中的變化情況。
　　研究結果:
　　1.從HE染色結果可以發(fā)現(xiàn)，隨暴露時間延長，大鼠肝臟的損傷程度逐漸加深。在低溫暴露0.5h即發(fā)生輕度肝細胞水腫，在低溫暴露4h后，可發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)變性、水腫，肝細胞有絲分裂增加并且出現(xiàn)大量雙核細胞和少數(shù)凋亡細胞。從電鏡結果可以發(fā)現(xiàn)，低溫暴露0.5h可導致肝細胞糖原減少，線粒體輕度腫脹；低溫暴露4h可致肝

7、細胞內(nèi)糖原耗竭，線粒體明顯腫脹，內(nèi)質網(wǎng)被壓縮，包繞于線粒體周圍。
　　2.通過對肝細胞ATP含量的測定，發(fā)現(xiàn)在低溫暴露0.5h，肝細胞ATP含量明顯增加，并隨暴露時間延長而逐漸降低（p＜0.05）。
　　3.western blot的檢測結果發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt-mTOR通路相關蛋白出現(xiàn)先升高后降低的一過性激活，Akt蛋白的Ser-473位點、Thr-308位點；mTOR蛋白的Ser-2448位點、Ser-2481位點和p

8、70S6K蛋白的Thr-389位點在低溫暴露0.5h的磷酸化程度明顯升高，隨暴露時間延長而逐漸降低。在對線粒體蛋白的測定發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白和mTOR蛋白在線粒體內(nèi)的表達與其在胞質中的表達趨勢一致。另外，與能量相關的AMPK蛋白的Thr-172位點隨暴露時間延長而磷酸化程度逐漸增加。
　　4.為進一步證實急性低溫暴露可以誘導大鼠肝臟有絲分裂增加及雙核細胞形成增加，利用免疫組織化學方法對大鼠肝臟雙核細胞進行計數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)在低溫暴露4h后

9、，大鼠肝臟有絲分裂期細胞數(shù)量明顯增加，并且雙核細胞數(shù)量明顯增加（p＜0.05）。
　　5.通過腹腔注射抑制劑渥曼青霉素（wortmannin），可以發(fā)現(xiàn)低溫暴露4h大鼠的肝臟細胞ATP水平與非抑制劑處理組相比明顯降低，與室溫對照組相比明顯升高（p＜0.05）。大鼠肝臟有絲分裂期細胞所占比例無明顯改變，雙核細胞的數(shù)量明顯增加（p＜0.05）。
　　研究結論:
　　1.急性低溫暴露4h可以引起大鼠肝臟損傷，引起肝細胞ATP