急性低溫暴露對(duì)大鼠肝臟的損傷及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　寒冷地區(qū)的冬季，人們?cè)趹敉饣顒?dòng)時(shí)會(huì)暴露于低溫環(huán)境中。從事低溫環(huán)境作業(yè)的人員和參加特殊環(huán)境軍事活動(dòng)的官兵也經(jīng)常暴露于低溫環(huán)境中。低溫環(huán)境對(duì)機(jī)體的影響和如何預(yù)防低溫暴露相關(guān)疾病一直是人們研究的熱點(diǎn)，具有重要意義。
　　低溫環(huán)境對(duì)人體造成損傷的機(jī)制以其特殊的軍事地位和作用，很少有相關(guān)內(nèi)容的公開(kāi)報(bào)道。目前，人們對(duì)于低溫環(huán)境對(duì)機(jī)體損傷機(jī)制的研究多限于長(zhǎng)期的慢性暴露模型，而急性的低溫暴露模型尚未見(jiàn)到相關(guān)的報(bào)道。在北方高寒

2、地區(qū)冬季，部隊(duì)執(zhí)行野外巡邏和站崗任務(wù)的士兵需要暴露在寒冷環(huán)境中，如果防護(hù)措施不當(dāng)則很容易造成急性凍傷。目前，對(duì)于急性寒冷損傷的研究多集中在體表皮膚及肌肉組織的凍傷，而體內(nèi)臟器在急性低溫暴露時(shí)受到的影響及其發(fā)揮的作用尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。人體暴露于低溫環(huán)境后，需要?jiǎng)訂T產(chǎn)熱以維持體溫。雖然在此時(shí)肌肉的寒顫產(chǎn)熱占主導(dǎo)作用，但肝臟作為體內(nèi)最大的糖原儲(chǔ)存器官和靜息狀態(tài)的主要產(chǎn)熱器官，也可能參與到急性低溫暴露下機(jī)體的應(yīng)激過(guò)程中。在大鼠和人的正常生長(zhǎng)過(guò)程

3、中，肝臟可以形成一定數(shù)量的雙核細(xì)胞，雙核細(xì)胞的形成可能與肝臟損傷和增殖能力相關(guān)。在能量缺乏或其他損傷效應(yīng)作用下，肝細(xì)胞有絲分裂失敗而形成雙核細(xì)胞。PI3K-Akt-mTOR通路是重要的生存信號(hào)通路，參與細(xì)胞的能量代謝，增殖分化，生長(zhǎng)繁殖等重要過(guò)程。其在低溫暴露過(guò)程中起到的作用已在慢性模型中進(jìn)行相關(guān)研究，但在急性低溫暴露模型中及在肝臟中的相關(guān)作用尚未闡明。
　　本研究試圖通過(guò)建立急性低溫暴露模型，探討急性低溫暴露是否可以引起肝臟病理

4、生理學(xué)改變，并探討PI3K-Akt-mTOR通路是否參與了急性低溫暴露過(guò)程中的應(yīng)答過(guò)程及其調(diào)控機(jī)制，為探索更多的低溫暴露效應(yīng)標(biāo)志物及預(yù)防靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.在大鼠急性低溫暴露模型中，研究急性低溫暴露引起大鼠肝臟的病理生理學(xué)改變，觀察肝臟有絲分裂細(xì)胞及雙核細(xì)胞在低溫暴露過(guò)程中數(shù)量的變化及細(xì)胞能量水平的變化。同時(shí)觀察PI3K-Akt-mTOR通路的變化情況及其與肝臟病理生理改變的關(guān)系。
　　2.通過(guò)

5、使用通路抑制劑，觀察PI3K-Akt-mTOR通路與肝細(xì)胞能量水平變化的關(guān)系及其是否參與了肝細(xì)胞有絲分裂增加及雙核細(xì)胞形成的過(guò)程。
　　研究方法:
　　1.利用低溫實(shí)驗(yàn)艙，建立大鼠急性低溫暴露模型：暴露溫度為﹣15℃，暴露時(shí)間為0.5h、1h、2h和4h。
　　2.利用組化方法，通過(guò)HE染色觀察急性低溫暴露后大鼠肝臟的損傷情況及雙核細(xì)胞的形成。
　　3.利用電鏡，觀察急性低溫暴露對(duì)大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響。

6、　　4.利用western blot方法，觀察PI3K-Akt-mTOR通路在急性低溫暴露中的變化情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.從HE染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肝臟的損傷程度逐漸加深。在低溫暴露0.5h即發(fā)生輕度肝細(xì)胞水腫，在低溫暴露4h后，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)變性、水腫，肝細(xì)胞有絲分裂增加并且出現(xiàn)大量雙核細(xì)胞和少數(shù)凋亡細(xì)胞。從電鏡結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，低溫暴露0.5h可導(dǎo)致肝細(xì)胞糖原減少，線粒體輕度腫脹；低溫暴露4h可致肝

7、細(xì)胞內(nèi)糖原耗竭，線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被壓縮，包繞于線粒體周圍。
　　2.通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞ATP含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在低溫暴露0.5h，肝細(xì)胞ATP含量明顯增加，并隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低（p＜0.05）。
　　3.western blot的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt-mTOR通路相關(guān)蛋白出現(xiàn)先升高后降低的一過(guò)性激活，Akt蛋白的Ser-473位點(diǎn)、Thr-308位點(diǎn)；mTOR蛋白的Ser-2448位點(diǎn)、Ser-2481位點(diǎn)和p

8、70S6K蛋白的Thr-389位點(diǎn)在低溫暴露0.5h的磷酸化程度明顯升高，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。在對(duì)線粒體蛋白的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白和mTOR蛋白在線粒體內(nèi)的表達(dá)與其在胞質(zhì)中的表達(dá)趨勢(shì)一致。另外，與能量相關(guān)的AMPK蛋白的Thr-172位點(diǎn)隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而磷酸化程度逐漸增加。
　　4.為進(jìn)一步證實(shí)急性低溫暴露可以誘導(dǎo)大鼠肝臟有絲分裂增加及雙核細(xì)胞形成增加，利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)大鼠肝臟雙核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫暴露4h后

9、，大鼠肝臟有絲分裂期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且雙核細(xì)胞數(shù)量明顯增加（p＜0.05）。
　　5.通過(guò)腹腔注射抑制劑渥曼青霉素（wortmannin），可以發(fā)現(xiàn)低溫暴露4h大鼠的肝臟細(xì)胞ATP水平與非抑制劑處理組相比明顯降低，與室溫對(duì)照組相比明顯升高（p＜0.05）。大鼠肝臟有絲分裂期細(xì)胞所占比例無(wú)明顯改變，雙核細(xì)胞的數(shù)量明顯增加（p＜0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　1.急性低溫暴露4h可以引起大鼠肝臟損傷，引起肝細(xì)胞ATP