間歇低氧對(duì)肝臟損傷機(jī)制及自噬在肝臟中作用機(jī)制的探討.pdf

1、目的：阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)有超過(guò)10％的人群罹患此病。OSA對(duì)于身體的嚴(yán)重危害及致死率增加，主要是因?yàn)镺SA常合并糖尿病，代謝綜合征，心血管系統(tǒng)疾病等。目前很多證據(jù)顯示，由于OSA患者發(fā)生了氣體交換障礙（反復(fù)低血氧和高碳酸血癥）的病生理改變，即慢性間歇低氧（CIH），導(dǎo)致前炎癥因子產(chǎn)物增多，血管內(nèi)皮功能紊亂，氧化應(yīng)激，代謝調(diào)節(jié)異常和胰島素抵抗等。因?yàn)楦闻K在人體是十分重要的代謝器官，肝細(xì)胞對(duì)各種內(nèi)源性和

2、外源性刺激如病毒感染、炎癥、營(yíng)養(yǎng)等非常敏感，現(xiàn)有很多報(bào)道OSA與肝臟的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）有關(guān)。本研究旨在通過(guò)間歇低氧動(dòng)物模型探討間歇低氧引起的肝臟損害，對(duì)肝臟藥物代謝酶細(xì)胞色素酶P450（CYPs）的影響及作用機(jī)制，從自噬角度對(duì)間歇低氧的作用做了進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖皮質(zhì)激素受體（GR）對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞色素酶P450（Cyps）的表達(dá)有重要的調(diào)控作用，并且對(duì)自噬有一定影響，所以又通過(guò)人的正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞初步探討糖皮質(zhì)激素

3、在人肝臟細(xì)胞CYPs代謝的影響及自噬中的作用。
　　方法：
　　1.建立間歇低氧（IH）大鼠模型，將30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組（按照每組15只分組）：IH組和對(duì)照組。
　　2.大鼠肝臟組織進(jìn)行固定、包埋、病理切片，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。
　　3.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定炎癥因子、Cyps、NF-κB、核受體的相對(duì)基因表達(dá)量。
　　4.使用實(shí)時(shí)定量PCR法分析肝

4、臟自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)。
　　5.將人正常肝細(xì)胞 LO2肝細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，然后傳代，將傳代細(xì)胞按順序分別接種于6孔板，根據(jù)加入藥物不同，分為對(duì)照組，糖皮質(zhì)激素（地塞米松， DEX）組和糖皮質(zhì)激素+糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑（DEX+R）組；對(duì)照組：正常細(xì)胞培養(yǎng)；DEX組：加入地塞米松進(jìn)行培養(yǎng)；DEX+R組：在DEX組基礎(chǔ)上加用糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑。
　　6.通過(guò)倒置顯微鏡觀察人肝細(xì)胞 LO2細(xì)胞形態(tài)的改變及生長(zhǎng)情況變化并進(jìn)行拍

5、照。
　　7.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定肝細(xì)胞LO2細(xì)胞Cyps的相對(duì)基因表達(dá)量。
　　8.使用實(shí)時(shí)定量PCR法分析測(cè)定肝細(xì)胞LO2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)照組和間歇低氧組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變：對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，竇狀隙及匯管區(qū)未見(jiàn)明顯增寬及結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞胞膜完整，胞質(zhì)豐富，胞核形態(tài)正常，與正常肝組織無(wú)差異；間歇低氧組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，竇狀隙呈輕度增寬，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)

6、可見(jiàn)少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，少許肝細(xì)胞胞質(zhì)稀疏。
　　2.肝組織炎癥介質(zhì)mRNA相對(duì)表達(dá)量的改變：IH組IL-1β、IL-6、TNFα mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高。
　　3.肝組織NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量的改變：IH組NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高。
　　4.核受體mRNA相對(duì)表達(dá)量的改變：IH組PXR、GR、CAR mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下調(diào)。
　　5.細(xì)胞色素氧化酶 P4

7、50（Cyps）mRNA相對(duì)表達(dá)量的改變：IH組 Cyp1A2、Cyp2D4、Cyp3A2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Cyp2C9、Cyp2C19 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　6.細(xì)胞自噬相關(guān)基因（Atg）相對(duì)表達(dá)量的改變：IH組與對(duì)照組相比，AMPK， mTOR，Beclin1，Atg5，Atg12，Atg13，ULK1均有相應(yīng)改變但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， LC3與WIPI的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

8、>　　7.肝LO2細(xì)胞生長(zhǎng)情況：地塞米松組LO2細(xì)胞生長(zhǎng)變形，呈梭形生長(zhǎng)，而加入糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑組，LO2細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組相同，為正常細(xì)胞形態(tài)。
　　8.肝LO2細(xì)胞Cyps表達(dá)：通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR詳細(xì)闡述了各組人細(xì)胞色素酶P450（hCYP450）中hCYP1A2、hCYP2C9、hCYP2C19、hCYP2D6、hCYP3A4 mRNA在人肝臟LO2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。與對(duì)照組相比，Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的hCYP1

9、A2、hCYP2C19、hCYP3A4 mRNA表達(dá)量上調(diào)，相應(yīng)的，Dex+R組人肝臟LO2細(xì)胞的上述基因表達(dá)下調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的hCYP2C9基因表達(dá)量較對(duì)照組為下降趨勢(shì)，hCYP2D6基因表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)顯著變化
　　9.肝LO2細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)：通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR詳細(xì)闡述了各組細(xì)胞的自噬相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，除 Dex組人肝臟LO2細(xì)胞的Beclin1 mR

10、NA表達(dá)量下調(diào)外，余細(xì)胞自噬相關(guān)的基因及參與自噬過(guò)程的自噬相關(guān)蛋白的基因表達(dá)量較對(duì)照組均無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：
　　1.間歇低氧可以引起肝臟結(jié)構(gòu)改變，促進(jìn)炎性因子釋放，并通過(guò) NF-κB-核受體通路來(lái)影響細(xì)胞色素酶Cyps的表達(dá)；
　　2.間歇低氧可以通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體通路誘導(dǎo)肝臟自噬，保護(hù)肝臟避免凋亡發(fā)生；
　　3.糖皮質(zhì)激素可以影響肝細(xì)胞生長(zhǎng)，并使細(xì)胞色素Cyps表達(dá)受影響；但是從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，對(duì)肝細(xì)胞自噬