Apelin對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、當(dāng)呼吸道或機(jī)體感染細(xì)菌、病毒及其他刺激物如脂多糖(LPS)等病原抗原成分和代謝產(chǎn)物時(shí)，可以誘導(dǎo)急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的發(fā)生發(fā)展，若病情惡化可以很快發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)，以進(jìn)行性呼吸窘迫與低氧血癥為臨床表現(xiàn)，是臨床常見的急危重癥，預(yù)后極差。ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激是其主要的機(jī)制之一。

2、>　　近年來，生物小分子活性肽在機(jī)體自穩(wěn)態(tài)中的調(diào)節(jié)作用的研究受到廣泛重視。Apelin是一種新型的小分子活性肽，Apelin及其受體APJ組織分布廣泛，通過內(nèi)分泌、旁/自分泌的方式維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。已有研究表明Apelin作為重要的生理調(diào)節(jié)肽，能夠調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)水鹽平衡，提示Apelin在維持肺循環(huán)穩(wěn)態(tài)、肺部疾病發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的重要效應(yīng)，但Apelin在ALI中的作用及其機(jī)制仍有待研究。
　　

3、研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)是誘導(dǎo)ALI的原因之一，核因子2(Nrf2)作為氧化應(yīng)激過程中非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，被證實(shí)在氧化應(yīng)激反應(yīng)中能夠發(fā)揮抗炎及抗氧化功能，促進(jìn)機(jī)體損傷修復(fù)，其調(diào)控機(jī)體對(duì)抗外來刺激及氧化損傷的重要作用已經(jīng)在多種免疫系統(tǒng)疾病中得到了證實(shí)，但在LPS誘導(dǎo)的ALI中具體保護(hù)機(jī)制仍有待探討。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)是機(jī)體炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)器，受到外來刺激時(shí)易被活化轉(zhuǎn)位入核，從而導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其在肺部炎癥疾病中的

4、重要病理作用已深入研究，但其與保護(hù)因子Nrf2在LPS誘導(dǎo)的ALI中的相互作用卻不清楚。
　　基于上述研究背景，我們推測(cè)Apelin可能參與了LPS誘導(dǎo)的ALI的調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)可能是通過促進(jìn)Nrf2的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制NF-κB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。為驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)性假設(shè)，本課題以Nrf2/NF-κB在LPS誘導(dǎo)ALI中的作用及Apelin調(diào)節(jié)機(jī)制為切入點(diǎn)，擬通過使用LPS作為炎癥刺激劑制備大鼠急性肺損傷模型，首先觀察了肺組織病

5、理學(xué)改變，分析了TNF-α等炎癥因子、肺組織干濕重比(W/D)及肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)量的變化。其次，檢測(cè)了肺組織相關(guān)氧化產(chǎn)物含量及抗氧化酶活性，以及NF-κB、Nrf2等蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　1.LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型建立:選取成年雄性SD大鼠（250g左右）32只，隨機(jī)均分為4組，分別為Control組、LPS組、LPS+Apelin組、Control+Apelin組，其中LPS組和LPS+Apelin組于大

6、鼠氣管緩慢滴注LPS(5mg/kg)，Control組、Control+Apelin組氣管滴注同等劑量的生理鹽水，LPS+Apelin組與Control+Apelin組在LPS滴注4小時(shí)后腹腔注射apelin(10nmol/kg)，以后每間隔6h注射一次，LPS注射24h后，收集大鼠血漿、肺組織、肺泡灌洗液等樣本，通過HE染色法觀察肺組織病理改變，結(jié)果顯示LPS組肺泡壁毛細(xì)血管充血嚴(yán)重，細(xì)支氣管腔內(nèi)有較多脫落炎性細(xì)胞及滲出物。LPS+A

7、pelin組與LPS組呈現(xiàn)相似的病理組織學(xué)變化，但相應(yīng)損傷程度明顯減輕;通過檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量觀察毛細(xì)血管的滲漏情況，LPS組細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量、中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分率、單核細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分率均顯著增加，肺泡吞噬細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比均顯著下降(p＜0.01);右肺稱重記錄肺濕/干重比(W/D)，LPS組顯著高于Control組，LPS+Apelin組顯著低于LPS組(p均＜0.05）;血?dú)夥治鲈u(píng)估機(jī)體酸堿平衡

8、失調(diào)情況及缺氧程度以輔助判斷急性肺損傷情況，結(jié)果表明，LPS組的PaO2值降低而PaCO2數(shù)值上升， LPS+Apelin組PaO2值顯著高于LPS組(p＜0.05)。這些結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI模型制備成功，Apelin對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI具有保護(hù)作用。
　　2.采用Elisa方法測(cè)定肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α MCP-1等炎癥因子水平，結(jié)果顯示LPS組大鼠肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α、MCP-1等炎癥因子明顯增加

9、，LPS+Apelin組炎癥因子水平顯著緩解(p＜0.05）。采用Western Blot技術(shù)測(cè)定大鼠肺組織中Nrf2、NOD2、CAMKII、NF-κB p65、p-ERK蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，LPS組肺組織NOD2、CAMKII、p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著高于Control組，LPS+Apelin組相關(guān)蛋白表達(dá)水平低于LPS組(p＜0.05），LPS組肺組織胞核中Nrf2、NF-κB p65蛋白表達(dá)均高于Control組，LPS+Ap

10、elin組Nrf2胞核蛋白表達(dá)高于LPS組，NF-κB p65蛋白表達(dá)低于LPS組。這些結(jié)果表明，Apelin能增強(qiáng)Nrf2抗氧化活性，抑制NF-κB表達(dá)從而減緩ALI的嚴(yán)重程度。
　　3.采用TBA法等測(cè)定肺組織中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、羥自由基(·OH)等氧化產(chǎn)物及氧自由基含量。結(jié)果表明，LPS組·OH、NO、MDA含量顯著高于LPS+Apelin組(p均＜0.05）;采用微量酶標(biāo)法等檢測(cè)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH

11、-PX)、過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、乳酸脫氫酶(LDH)等抗氧化酶、損傷相關(guān)酶活力變化。結(jié)果表明，LPS組肺組織GSH-PX、CAT、SOD酶活力顯著低于LPS+Apelin組(p＜0.05)，損傷相關(guān)酶LDH、MPO酶活力顯著高于LPS+Apelin組。這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了LPS誘導(dǎo)的ALI進(jìn)程，Apelin能夠一定程度減緩氧化產(chǎn)物的生成，增強(qiáng)抗氧化酶活性。
　　綜上所述