雙環(huán)醇對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷和肝臟再生的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究根據(jù)雙環(huán)醇的藥理作用特點(diǎn)，分別選用大鼠70％HIRI和PH兩個(gè)模型，研究雙環(huán)醇對(duì)HIRI的保護(hù)作用以及對(duì)PH大鼠肝臟再生的促進(jìn)作用，并進(jìn)一步探討其相關(guān)分子機(jī)制。 1.雙環(huán)醇對(duì)大鼠HIRI的保護(hù)作用及機(jī)制研究。 采用Yoshizumi等方法建立大鼠HIRI模型，即缺血90min后進(jìn)行再灌1h、3h、6h和24h。雙環(huán)醇(100、200、300mg/kg)可顯著降低I/R引起大鼠血清ALT和TBil的異常升高，并呈一定

2、的劑量效應(yīng)關(guān)系，上述肝臟病理形態(tài)學(xué)改變也明顯減輕。雙環(huán)醇(300 mg/kg)還可明顯減少HIRI引起的動(dòng)物死亡，使存活率升至90％。 已知HIRI導(dǎo)致肝損傷的主要原因是缺血再灌過程中產(chǎn)生大量活性氧(ROS)和活性氮(RNS)。雙環(huán)醇(200、300 mg/kg)可顯著抑制肝臟和微粒體MDA含量的升高，恢復(fù)抗氧化酶SOD的活性。 氧化/硝化應(yīng)激是缺血再灌引起肝損傷的重要機(jī)制之一。雙環(huán)醇(100、200、300 mg/kg

3、)對(duì)肝臟MPO、iNOS活性和亞硝酸鹽/硝酸鹽水平升高具有明顯的抑制作用，并呈一定劑量效應(yīng)關(guān)系。 缺血再灌誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制中，炎癥因子和抗炎因子水平失衡是產(chǎn)生炎性損傷的主要因素。I/R大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)隨再灌時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，抗炎因子白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)也明顯增加。同時(shí)，模型組動(dòng)物肝臟TNF-α和IL-10基因表達(dá)明顯高于SM組。雙環(huán)醇(300 mg/kg)可抑制I/R大鼠血清和肝臟TNF-α過

4、表達(dá)，并進(jìn)一步上調(diào)血清和肝臟IL-10表達(dá)。此外，雙環(huán)醇(300 mg/kg)還可減少I/R大鼠肝臟細(xì)胞間粘附分子(ICAM—1)和P—selectin的表達(dá)。 肝臟缺血再灌時(shí)腸道革蘭氏陰性桿菌釋放的內(nèi)毒素(脂多糖)可進(jìn)一步加重肝損傷。雙環(huán)醇(300mg/kg)可明顯抑制I/R大鼠血漿內(nèi)毒素水平的異常升高。 Toll樣受體4(TLR4)是LPS受體的關(guān)鍵組成部分，在LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要作用。雙環(huán)醇(300mg/k

5、g)可明顯下調(diào)I/R大鼠肝組織TLR4蛋白表達(dá)。 由此可見，雙環(huán)醇對(duì)大鼠HIRI具有顯著的保護(hù)作用，其肝保護(hù)作用機(jī)理與抑制氧化應(yīng)激，降低內(nèi)毒素水平，調(diào)控TLR4和NF—κB表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥因子/抗炎因子表達(dá)失衡密切相關(guān)。 2.雙環(huán)醇對(duì)HIRI大鼠肝臟CYP450活性和表達(dá)的影響。 細(xì)胞色素P450(CYP450)是一種多功能藥物代謝酶系，參與內(nèi)外源性化合物的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化。 肝微粒體CYP450含量可初步反映

6、肝臟依賴CYP450催化的氧化活性。 四種常見CYP450同工酶(CYP2C6、2C11、2E1和3A1/2)的活性和表達(dá)在HIRI大鼠出現(xiàn)差異性改變。 CYP2E1可氧化乙醇、四氯化碳和其他引起肝毒性的小分子化合物。 CYP3A亞家族在臨床口服藥物的代謝中發(fā)揮重要作用。 由此可見，雙環(huán)醇預(yù)防給藥可明顯減輕HIRI時(shí)CYP450同工酶活性和表達(dá)的改變。作用機(jī)制可能與其抗氧化和抗炎作用密切相關(guān)。 3

7、.雙環(huán)醇對(duì)PH大鼠肝臟再生的作用及機(jī)制研究。 PH模型是研究肝細(xì)胞再生的理想動(dòng)物模型，本研究采用Higgins和Anderson方法建立大鼠70％PH模型，研究雙環(huán)醇對(duì)PH大鼠肝臟再生的作用及其相關(guān)機(jī)制。PH術(shù)后大鼠肝重、肝重/體重和肝再生率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，雙環(huán)醇(300mg/kg)則可進(jìn)一步提高PH大鼠肝重、肝重/體重和肝再生率，分別提高25％、26％和23％，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。此外，給藥組PH大鼠殘肝組織的分裂指

8、數(shù)(MI)(1.87±0.43)也顯著高于對(duì)照組(1.16±0.27)。 PH可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷，表現(xiàn)為術(shù)后6h時(shí)血清ALT和TBil水平顯著升高，分別為假手術(shù)(SH)組的1.7和3.5倍，同時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣和空泡樣變性等形態(tài)學(xué)改變。雙環(huán)醇(200、300mg/kg)可劑量依賴性抑制PH大鼠血清ALT和TBil水平的異常升高，并減輕肝臟病理學(xué)改變。 肝細(xì)胞增殖指數(shù)代表處于S期和G2—M期肝細(xì)胞的比例，可反映細(xì)胞分

9、裂程度。PH模型組S和G2—M期的比例顯著增加，為SH組的2.1倍，G0/G1期比例相應(yīng)下降至SH組的64％。雙環(huán)醇(300mg/kg)給藥組肝細(xì)胞G0/G1期比例下降至PH組的53％，S和G2—M期的比例則增加為PH組的1.4倍，提示雙環(huán)醇可明顯促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核內(nèi)酸性蛋白質(zhì)，其表達(dá)于細(xì)胞周期的G1晚期和S期。PH大鼠肝組織PCNA表達(dá)顯著增加，即有絲分裂期(G1和S期)的肝細(xì)

10、胞數(shù)目明顯增多，而雙環(huán)醇(300mg/kg)可進(jìn)一步上調(diào)PH大鼠肝組織PCNA的表達(dá)。 肝糖原可通過糖酵解途徑，三羧酸循環(huán)和檸檬酸途徑等氧化分解，產(chǎn)生ATP來(lái)維持肝細(xì)胞的功能和完整性。術(shù)后6h、24h和48h時(shí)肝糖原水平顯著降低至SH組的36％、31％和40％。雙環(huán)醇(200、300mg/kg)可劑量依賴性抑制PH大鼠肝糖原水平的下降。 肝臟是蛋白質(zhì)代謝非常旺盛的器官，是合成自身蛋白和大部分血漿蛋白的主要場(chǎng)所。PH術(shù)后各

11、組大鼠血清總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平均無(wú)顯著改變，且肝組織總蛋白含量均在410±45～505±57 mg prot/g liver tissue之間，組間無(wú)顯著差異。 ROS可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，還可激活細(xì)胞分裂周期的抑制性蛋白，從而阻礙肝細(xì)胞增殖。PH大鼠肝勻漿MDA含量于術(shù)后6h、24h和48h時(shí)分別升高為SH組的1.4倍、1.2倍和1.3倍，肝微粒體MDA含量在前兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比SH組分別增加63％和48％，而48h時(shí)

12、其含量與SH組基本相同。同時(shí)，肝臟SOD活性分別下降35％、17％和16％，GSH含量?jī)H于6h時(shí)顯著下降(49％)，24h和48h時(shí)逐漸恢復(fù)。雙環(huán)醇(300mg/kg)不僅可抑制PH大鼠肝勻漿和微粒體中MDA的生成，還可恢復(fù)肝臟SOD活性，抑制肝臟GSH耗竭。 由此可見，雙環(huán)醇可顯著提高PH大鼠殘肝組織的再生能力，并可明顯改善PH引起的肝損傷，其作用機(jī)制可能通過抑制氧化損傷以減輕ROS對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用，從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。

13、 4.雙環(huán)醇對(duì)PH大鼠肝臟CYP450活性和表達(dá)的影響。 肝微粒體中CYP450主要參與各種內(nèi)外源物在肝臟的生物轉(zhuǎn)化作用。PH引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子不僅阻礙肝細(xì)胞增殖，還可損傷肝微粒體CYP450酶。本研究可見PH大鼠肝微粒體CYP450含量于術(shù)后48h時(shí)下降至SH組的64％。雙環(huán)醇(300mg/kg)對(duì)PH大鼠肝微粒體CYP450含量下降具有明顯的抑制作用。由于CYP450同工酶的組成與其代謝功能密切相關(guān)，因此，進(jìn)一

14、步從CYP450同工酶(2C6、2C11、2E1和3A1/2)活性、mRNA和蛋白表達(dá)的角度，研究雙環(huán)醇對(duì)PH引起肝功能損傷的改善作用。 CYP2C6和2C11參與多種藥物的體內(nèi)代謝。PH大鼠肝微粒體CYP2C6活性于術(shù)后6h和48h時(shí)分別降至SH組的66％和27％，mRNA表達(dá)分別減少了24％和41％，雙環(huán)醇(300mg/kg)可明顯抑制CYP2C6活性和mRNA表達(dá)的下降。此外，PH大鼠肝微粒體CYP2C11活性子48h時(shí)也

15、明顯降低(58％)，mRNA表達(dá)無(wú)顯著改變。雙環(huán)醇(300mg/kg)對(duì)CYP2C11活性的下降無(wú)明顯作用。 CYP2E主要通過催化前致癌物去烷基、去硝基等反應(yīng)而使之轉(zhuǎn)化為致癌物。PH大鼠肝微粒體CYP2E1活性和mRNA表達(dá)均無(wú)顯著改變，但其蛋白表達(dá)卻于PH早期顯著下降，雙環(huán)醇(300mg/kg)可明顯下調(diào)CYP2E1蛋白表達(dá)。 CYP3A是肝臟中含量最豐富的CYP450形式，參與大部分口服藥物的首過效應(yīng)。PH大鼠肝微

16、粒體CYP3A1/2活性于48h時(shí)顯著下降(36％)，其mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。雙環(huán)醇(300mg/kg)可明顯上調(diào)肝臟CYP3A1mRNA和蛋白表達(dá)，并對(duì)CYP3A1/2活性的下降也有明顯抑制作用。 綜上所述，雙環(huán)醇對(duì)大鼠HIRI具有顯著的保護(hù)作用，并可明顯提高PH大鼠肝臟的再生能力，還可改善I/R和PH大鼠肝臟CYP450活性及表達(dá)的改變。其作用機(jī)制可歸納為： (1)抗氧化作用：抑制MDA、NO生成和GSH耗竭，

17、恢復(fù)SOD活性。 (2)調(diào)控中性粒細(xì)胞聚集和粘附分子表達(dá)：抑制MPO和iNOS活性，下調(diào)ICAM—1和P—selectin表達(dá)。 (3)抑制細(xì)菌內(nèi)毒素轉(zhuǎn)位：降低血漿內(nèi)毒素水平。 (4)調(diào)控炎癥因子/抗炎因子平衡：下調(diào)TNF-α，上調(diào)IL-10表達(dá)。 (5)調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路：下調(diào)TLR4和NF—κB蛋白表達(dá)。 (6)增加肝細(xì)胞分裂：上調(diào)PCNA表達(dá)，增加分裂指數(shù)MI和增殖指數(shù)。 (7)改