甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI E2F1和STAT3的表達及其意義.pdf

1、背景:甲狀腺腫瘤是人類頭頸部疾病中的常見病和多發(fā)病,而甲狀腺乳頭狀腺癌是甲狀腺腫瘤中最常見的惡性腫瘤,占相當大的比例。但我們對其發(fā)生發(fā)展的分子機制知之甚少。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素的生物學行為,因此探索不同基因在甲狀腺乳頭狀癌中表達作用情況,有助于我們更好的了解其發(fā)生機制及指導臨床治療。
　　 ARHI是YU等用差異顯示PCR的方法。從人卵巢和乳腺上皮細胞及其癌細胞中克隆出一種新的候選抑癌基因。YU等研究發(fā)現(xiàn)ARHI抑制G1期

2、cyclin-CDK的活性使細胞不能通過G1期,防止細胞過度增殖,大量研究表明,與正常乳腺上皮組織和卵巢上皮組織相比,ARHI在乳腺癌和卵巢癌中缺失或低表達,表明ARHI是腫瘤抑制基因。Lu Z等在卵巢癌細胞系SKOv3中,用EMSA(電泳遷移率實驗)方法,發(fā)現(xiàn)ARHI啟動子區(qū)域(-385到-409)有E2F1的結(jié)合位點,并且癌細胞中E2F的結(jié)合活性增強,E2F1負性調(diào)節(jié)ARHI啟動子活性。而Nishimoto等人通過酵母雙雜交實驗和免

3、疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)STAT3與ARHI相互作用,形成復合體,阻止了IL-6介導的STAT3進入細胞核,從而降低了STAT3與DNA的結(jié)合和STAT3依賴的啟動子活性。
　　 目的:本實驗采用病理形態(tài)學觀察和免疫組織化學研究甲狀腺乳頭狀癌中ARHI、E2F1、STAT3蛋白水平的表達情況。同時應用RT-PCR方法,研究甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI基因mRNA水平表達情況。以期探討ARHI、E2F1、STAT3在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達變

4、化規(guī)律和可能的調(diào)控機制,及它們之間是否具有相關性,并初步闡明三者蛋白表達在甲狀腺乳頭狀腺癌發(fā)生中的可能作用。
　　 方法:
　　 1研究對象
　　 選取河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院病理科2000年12月至2010年1月期間存檔蠟塊,所有病例診斷明確,臨床資料完整,包括88例甲狀腺乳頭狀腺癌、22例甲狀腺腺瘤、15例甲狀腺濾泡癌、12例甲狀腺髓樣癌、8例甲狀腺未分化癌,同時選取20例正常甲狀腺組織,用于各指標蛋白的免疫組織

5、化檢測。收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2009年3月-2009年8月間甲狀腺腫瘤手術切除標本共15例,臨床資料完整,手術切除并經(jīng)病理證實,包括甲狀腺乳頭狀腺癌11例,髓樣癌2例,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫1例,橋本氏甲狀腺炎1例。因為髓樣癌,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫,橋本氏甲狀腺炎例數(shù)太少,所以僅選取11例甲狀腺乳頭狀腺癌來研究,另取正常甲狀腺組織10例作為對照,用于檢測ARHI基因mRNA表達情況。所有的新鮮組織保存在-80℃冰箱中備用。
　　 2免疫組

6、織化學方法
　　 采用免疫組織化學SP兩步法,研究ARHI、E2F1、STAT3蛋白表達情況。具體操作按照免疫組織化學試劑盒進行。蘇木素復染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。
　　 3反轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)檢測mRNA的表達
　　 3.1細胞總RNA的提取、鑒定及定量
　　 采用異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性。
　　 3.2 RT-PCR方法

7、
　　 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,建立PCR反應體系,94℃變性5min,94℃50s,62℃30s,72℃30s,30次循環(huán)擴增,PCR產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳(90V,35min)。紫外分析儀觀察并照相。
　　 4統(tǒng)計分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計,X2檢驗、Pearson相關分析。
　　 結(jié)果:
　　 1 ARHI蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達情況
　　 88例

8、甲狀腺乳頭狀腺癌ARHI蛋白的陽性表達率為65.91％(58/88),15例甲狀腺濾泡癌中ARHI蛋白的陽性表達率為66.67％(10/15),統(tǒng)計結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌中ARHI蛋白的陽性表達率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05),另外,甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI蛋白陽性表達率明顯高于甲狀腺腺瘤、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌(P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌之間,甲狀腺腺瘤、髓樣癌、未分化癌和正常甲狀腺組織之間A

9、RHI蛋白陽性表達率差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2 E2F1蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達情況
　　 甲狀腺乳頭狀腺癌中E2F1蛋白的陽性表達率為70.45％(62/88);正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌中E2F1的陽性表達率分別為O％(0/20)、31.82％(7/22)、80％(12/15)、83.33％(10/12)、50％(4/8)。經(jīng)卡方檢驗,甲狀腺乳頭狀腺

10、癌中E2F1蛋白的陽性表達率明顯高于正常甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤(P＜0.05)。甲狀腺腺瘤、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌中E2F1蛋白的陽性表達率明顯高于正常甲狀腺(0％),差別有統(tǒng)計學意義(均是P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌與甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和未分化癌之間E2F1蛋白的陽性表達率差別無統(tǒng)計學意義中(P＞0.05)。
　　 3 STAT3蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中的表達情況
　　 甲狀腺乳頭狀腺癌中STAT3蛋白的陽性表

11、達率為79.55％(70/88)。正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌中STAT3蛋白的陽性表達率分別為35％(7/22)、72.73％(16/22)、86.67％(13/15)、100％(12/12)、87.5％(7/8)。統(tǒng)計結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭狀腺癌中STAT3蛋白的陽性表達率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。甲狀腺乳頭狀腺癌與甲狀腺腺瘤、濾泡癌、腺髓樣癌和未分化癌之間STAT3蛋白的陽性表

12、達率差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌中STAT3蛋白的陽性表達率明顯高于正常甲狀腺組織(P＜0.05)。
　　 4 ARHI、E2F1、STAT3在不同病例中表達情況的相關性研究
　　 在甲狀腺乳頭狀腺癌中,相關分析提示ARHI蛋白表達與E2F1蛋白表達呈正相關關系(r=0.238,P=0.026)。在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌中,A

13、RHI、E2F1、STAT3之間無相關關系。
　　 5 ARHI、E2F1、STAT3蛋白在甲狀腺乳頭狀腺癌中表達的臨床病理意義
　　 經(jīng)統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),在本研究中,ARHI、E2F1和STAT3蛋白表達與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)病年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關關系。
　　 6 ARHI基因mRNA在甲狀腺乳頭狀腺癌和正常甲狀腺組織中表達情況RT-PCR結(jié)果,10例正常甲狀腺組織和11例甲狀腺乳頭狀腺癌中,分別有7例和

14、8例可以檢測到ARHImRNA表達,陽性表達率分別為70％,72.73％。經(jīng)x2檢驗,正常甲狀腺組織和甲狀腺乳頭狀腺癌中ARHI基因mRNA陽性表達率差別無明顯的統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1印跡抑癌基因ARHI蛋白在正常甲狀腺組織中低表達,而在甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌中高表達,在甲狀腺髓樣癌和未分化癌中低表達,但在甲狀腺乳頭狀腺癌中mRNA水平未見明顯變化,提示ARHI作用可能存在組織差異,其蛋白

15、高表達可能在促進甲狀腺乳頭狀腺癌和濾泡癌發(fā)生中發(fā)揮一定作用。
　　 2與ARHI不同,不同類型甲狀腺癌中E2F1和STAT3蛋白表達水平都明顯高于正常甲狀腺組織,提示E2F1和STAT3蛋白高表達促進了不同類型甲狀腺癌的發(fā)生。
　　 3在甲狀腺乳頭狀腺癌中,E2F1與ARHI之間存在正相關關系,E2F1正性調(diào)節(jié)ARHI蛋白的表達。
　　 4 ARHI、E2F1和STAT3蛋白表達與甲狀腺乳頭狀腺癌的發(fā)病年齡、性別