轉(zhuǎn)錄因子FOXK2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及功能機(jī)制研究.pdf

1、目的：FOXK2是Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)FOXK2廣泛參與多種生物學(xué)過程，并且在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色。目前已經(jīng)陸續(xù)有FOXK2在乳腺癌及結(jié)腸癌中的研究報(bào)道。然而，F(xiàn)OXK2在腎透明細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)主要研究FOXK2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，同時(shí)結(jié)合臨床病理資料及隨訪結(jié)果，研究其對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響。同時(shí)通過一系列體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其在腎透明細(xì)胞癌中發(fā)

2、揮的生物學(xué)功能進(jìn)行研究，另外，利用基因芯片檢測(cè)篩選出潛在的下游靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法：①通過實(shí)時(shí)定量PCR、Western-Blot及免疫組化檢測(cè)42例腎透明細(xì)胞癌及配對(duì)癌旁正常腎組織標(biāo)本中FOXK2的mRNA以及蛋白的表達(dá)水平。將定量檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床資料，進(jìn)一步闡明FOXK2的表達(dá)水平對(duì)腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響。②分別在786-O及769-P細(xì)胞中敲低和過表達(dá)FOXK2，進(jìn)一步在體外研究FOXK2對(duì)腎癌細(xì)胞惡性表型的影響

3、。③通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲低及過表達(dá)FOXK2后786-O及769-P細(xì)胞周期及凋亡的變化。④構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FOXK2的裸鼠皮下移植瘤模型，檢測(cè)FOXK2在體內(nèi)對(duì)腎透明細(xì)胞癌生長(zhǎng)的影響。⑤通過Affymetrix GeneChip(@)Human Transcriptome Array2.0對(duì)過表達(dá)FOXK2的769-P細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測(cè)，通過分析篩選潛在的下游靶基因并進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：①與對(duì)應(yīng)的癌旁正常腎組織相比，F(xiàn)OX

4、K2的mRNA和蛋白表達(dá)水平在腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本中顯著的降低(p＜0.01)。并且在相對(duì)較晚的臨床T分期、較長(zhǎng)腫瘤直徑以及較高Fuhrman分級(jí)的患者中FOXK2的mRNA呈現(xiàn)相對(duì)較低的表達(dá)水平。Kaplan-Meier生存分析顯示FOXK2mRNA低表達(dá)組的DFS較高表達(dá)組更差。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示低表達(dá)的FOXK2mRNA是腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=4.115，p=0.034)。②在4種腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株中，

5、FOXK2的表達(dá)水平均低于在正常腎小管上皮細(xì)胞株中的表達(dá)，并且在786-O中表達(dá)相對(duì)較高，在769-P中表達(dá)相對(duì)較低;769-P腎癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移以及運(yùn)動(dòng)能力在過表達(dá)FOXK2后受到了顯著抑制;而敲低FOXK2后，786-O細(xì)胞的上述能力得到顯著增強(qiáng)。③在769-P及786-O細(xì)胞中過表達(dá)FOXK2后可以顯著的增加細(xì)胞的凋亡比例，使Bcl-2以及Caspase-3的表達(dá)水平降低，同時(shí)使cleaved Caspase-3

6、的表達(dá)水平升高。④裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)OXK2在體內(nèi)可以通過誘導(dǎo)凋亡進(jìn)而抑制腎透明細(xì)胞癌的生長(zhǎng)增殖。⑤通過對(duì)過表達(dá)FOXK2的769-P細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)譜芯片檢測(cè)及分析后發(fā)現(xiàn)，EGFR是FOXK2的潛在下游靶基因，并且FOXK2可能通過抑制EGFR進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制的作用。
　　結(jié)論：FOXK2在腎透明細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，其表達(dá)水平降低是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。FOXK2在體外及體內(nèi)可以通過誘導(dǎo)凋亡進(jìn)而抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的惡性表型