鈣結(jié)合蛋白S100P在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)與功能研究.pdf

1、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在人類妊娠早期胚泡植入過程中發(fā)揮著重要作用，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等功能適度是生理妊娠建立、維持和適時(shí)終止的關(guān)鍵。功能過強(qiáng)可能發(fā)生滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（如葡萄胎、絨毛膜癌等）;過弱則可導(dǎo)致妊娠失?。ㄈ缱匀涣鳟a(chǎn)、早產(chǎn)等）和病理妊娠（如子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長受限等）。滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常的分子機(jī)制一直被廣泛研究，然而通過何種關(guān)鍵性靶分子，經(jīng)過何種細(xì)胞途徑作用于滋養(yǎng)細(xì)胞，從而引起增殖、侵襲等生物學(xué)行為改變的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。

2、r>　　S100P是鈣結(jié)合蛋白S100家族的一員，在人類胎盤組織中首次被檢測到，其發(fā)現(xiàn)即預(yù)示著與妊娠關(guān)系密切。然而，目前尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道S100P在人類妊娠不同階段胎盤組織的表達(dá)和分布——也沒有報(bào)道S100P與滋養(yǎng)細(xì)胞功能之間的關(guān)系。
　　本研究首先檢測了S100P在正常妊娠不同階段胎盤組織的表達(dá)模式，并比較了自然流產(chǎn)及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中S100P表達(dá)的差異;其次，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)來研究S100P對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的

3、影響及可能的分子作用機(jī)制。本研究旨在探討S100P表達(dá)與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能的相關(guān)性，
　　第一部分 S100P在胎盤組織中的表達(dá)
　　目的:
　　探討S100P在正常妊娠不同階段絨毛或者胎盤組織以及早孕期自然流產(chǎn)絨毛組織以及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)。
　　方法:
　　利用RT-PCR、定量實(shí)時(shí)PCR、western-blot以及免疫組織化學(xué)染色法檢測S100P在胎盤組織中的表達(dá)。
　　(1)收集正常妊娠

4、不同階段絨毛或胎盤組織，包括12個(gè)早孕期絨毛組織，10個(gè)中孕期胎盤組織，和12個(gè)足月妊娠胎盤組織，檢測S100P在絨毛和胎盤組織的表達(dá)與定位。
　　(2)比較16個(gè)早孕期自然流產(chǎn)與12個(gè)早孕期正常妊娠絨毛組織，比較兩組S100P表達(dá)量的差異;
　　(3)收集了23例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的組織樣本，10例葡萄胎、3例侵襲性葡萄胎、10例絨毛膜癌，其中5例同時(shí)具有原發(fā)灶組織和轉(zhuǎn)移灶組織;對葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶

5、組織的S100P蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫組化表達(dá)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)S100P在整個(gè)妊娠階段早孕期、中孕期以及足月妊娠絨毛或胎盤組織均呈高表達(dá)，相比較而言，早孕期絨毛組織的S100P mRNA和蛋白表達(dá)水平更高一些。免疫組化法檢測到S100P蛋白在絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞強(qiáng)陽性表達(dá)，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度表達(dá)。S100P在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞漿均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞柱只表達(dá)于細(xì)胞漿。在中孕期與足月妊

6、娠胎盤，S100P在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)。
　　(2)與早孕期正常妊娠絨毛組織相比，自然流產(chǎn)絨毛組織的S100P蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　(3)在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤標(biāo)本中，10例葡萄胎組織的免疫組化結(jié)果顯示，部分病人(3/10) S100P蛋白在合體滋養(yǎng)細(xì)胞為強(qiáng)陽性，在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞為中等強(qiáng)度陽性或強(qiáng)陽性表達(dá);而在3例侵蝕性葡萄胎(3/3)、6例絨毛膜癌原發(fā)灶(6/10)和5例肺轉(zhuǎn)移灶組織(5/5)

7、中，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞S100P均為強(qiáng)陽性表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　S100P在正常妊娠不同階段胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的特異性表達(dá)和分布顯示其在滋養(yǎng)細(xì)胞的功能可能隨著定位不同發(fā)生改變。S100P在早孕期自然流產(chǎn)絨毛組織中表達(dá)量下降且在良惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤表達(dá)存在差異，提示S100P與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能可能存在一定的關(guān)系，但具體作用與可能的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　第二部分 S100P對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及分子機(jī)制探討
　

8、　目的:
　　探討S100P對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:培養(yǎng)JAR和JEG-3滋養(yǎng)細(xì)胞系，構(gòu)建真核表達(dá)載體和小干擾RNA分別轉(zhuǎn)染JAR細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞。不同分組滋養(yǎng)細(xì)胞分別用XTT細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分析S100P對滋養(yǎng)細(xì)胞生長、凋亡、克隆形成及遷移能力的影響。體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)部分:應(yīng)用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)和尾靜脈注

9、射轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)觀察S100P對滋養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力和細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。為了進(jìn)一步探討S100P的作用機(jī)制，我們用western-blot檢測P38信號通路相關(guān)分子在JAR細(xì)胞中的作用。
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建S100P真核表達(dá)載體和S100P小干擾RNA（siRNA1、siRNA2），轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR和JEG-3。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)S100P的JAR和JEG-3細(xì)胞均比對照組（空載體轉(zhuǎn)染組）細(xì)胞生長能力增快，細(xì)胞克隆形成

10、能力增加，且細(xì)胞體外遷移能力亦明顯增加(P＜0.05)。與之相反，轉(zhuǎn)染小干擾RNA的滋養(yǎng)細(xì)胞生長能力要明顯慢于對照組，且細(xì)胞克隆形成能力降低，體外遷移能力也降低(P＜0.05)。
　　(2)我們接著檢測上調(diào)S100P的表達(dá)水平對裸鼠體內(nèi)成瘤能力和尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤形成的影響，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組細(xì)胞相比，S100P過表達(dá)滋養(yǎng)細(xì)胞形成的腫瘤體積明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，轉(zhuǎn)移瘤實(shí)驗(yàn)顯示S100P過

11、表達(dá)組JAR細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　(3)進(jìn)一步分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S100P過表達(dá)后滋養(yǎng)細(xì)胞JAR的P-P38和P-ERK表達(dá)升高;利用抑制劑SB203580阻斷P38 MAPK，上調(diào)S100P的表達(dá)不能促進(jìn)JAR細(xì)胞的增殖作用，而ERK通路抑制劑PD98059阻斷后對S100P引起的細(xì)胞增殖沒有作用。
　　結(jié)論:
　　S100P可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的體外增殖、克隆、遷移能力以及體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)