鈣結(jié)合蛋白S100P在胎盤滋養(yǎng)細胞的表達與功能研究.pdf

1、胎盤滋養(yǎng)細胞在人類妊娠早期胚泡植入過程中發(fā)揮著重要作用，滋養(yǎng)細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等功能適度是生理妊娠建立、維持和適時終止的關(guān)鍵。功能過強可能發(fā)生滋養(yǎng)細胞腫瘤（如葡萄胎、絨毛膜癌等）;過弱則可導致妊娠失?。ㄈ缱匀涣鳟a(chǎn)、早產(chǎn)等）和病理妊娠（如子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長受限等）。滋養(yǎng)細胞功能異常的分子機制一直被廣泛研究，然而通過何種關(guān)鍵性靶分子，經(jīng)過何種細胞途徑作用于滋養(yǎng)細胞，從而引起增殖、侵襲等生物學行為改變的分子生物學機制尚不明確。

2、r>　　S100P是鈣結(jié)合蛋白S100家族的一員，在人類胎盤組織中首次被檢測到，其發(fā)現(xiàn)即預示著與妊娠關(guān)系密切。然而，目前尚沒有文獻報道S100P在人類妊娠不同階段胎盤組織的表達和分布——也沒有報道S100P與滋養(yǎng)細胞功能之間的關(guān)系。
　　本研究首先檢測了S100P在正常妊娠不同階段胎盤組織的表達模式，并比較了自然流產(chǎn)及妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤中S100P表達的差異;其次，通過體外細胞實驗及體內(nèi)動物實驗來研究S100P對滋養(yǎng)細胞生物學功能的

3、影響及可能的分子作用機制。本研究旨在探討S100P表達與胎盤滋養(yǎng)細胞功能的相關(guān)性，
　　第一部分 S100P在胎盤組織中的表達
　　目的:
　　探討S100P在正常妊娠不同階段絨毛或者胎盤組織以及早孕期自然流產(chǎn)絨毛組織以及妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤中的表達。
　　方法:
　　利用RT-PCR、定量實時PCR、western-blot以及免疫組織化學染色法檢測S100P在胎盤組織中的表達。
　　(1)收集正常妊娠

4、不同階段絨毛或胎盤組織，包括12個早孕期絨毛組織，10個中孕期胎盤組織，和12個足月妊娠胎盤組織，檢測S100P在絨毛和胎盤組織的表達與定位。
　　(2)比較16個早孕期自然流產(chǎn)與12個早孕期正常妊娠絨毛組織，比較兩組S100P表達量的差異;
　　(3)收集了23例妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的組織樣本，10例葡萄胎、3例侵襲性葡萄胎、10例絨毛膜癌，其中5例同時具有原發(fā)灶組織和轉(zhuǎn)移灶組織;對葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶

5、組織的S100P蛋白表達進行免疫組化表達分析。
　　結(jié)果:
　　(1)S100P在整個妊娠階段早孕期、中孕期以及足月妊娠絨毛或胎盤組織均呈高表達，相比較而言，早孕期絨毛組織的S100P mRNA和蛋白表達水平更高一些。免疫組化法檢測到S100P蛋白在絨毛合體滋養(yǎng)細胞強陽性表達，細胞滋養(yǎng)細胞發(fā)現(xiàn)中等強度表達。S100P在合體滋養(yǎng)細胞的細胞核及細胞漿均呈強陽性表達，而在細胞滋養(yǎng)細胞及細胞滋養(yǎng)細胞柱只表達于細胞漿。在中孕期與足月妊

6、娠胎盤，S100P在合體滋養(yǎng)細胞的細胞核和細胞漿表達。
　　(2)與早孕期正常妊娠絨毛組織相比，自然流產(chǎn)絨毛組織的S100P蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。
　　(3)在妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤標本中，10例葡萄胎組織的免疫組化結(jié)果顯示，部分病人(3/10) S100P蛋白在合體滋養(yǎng)細胞為強陽性，在細胞滋養(yǎng)細胞為中等強度陽性或強陽性表達;而在3例侵蝕性葡萄胎(3/3)、6例絨毛膜癌原發(fā)灶(6/10)和5例肺轉(zhuǎn)移灶組織(5/5)

7、中，細胞滋養(yǎng)細胞S100P均為強陽性表達。
　　結(jié)論:
　　S100P在正常妊娠不同階段胎盤滋養(yǎng)細胞的特異性表達和分布顯示其在滋養(yǎng)細胞的功能可能隨著定位不同發(fā)生改變。S100P在早孕期自然流產(chǎn)絨毛組織中表達量下降且在良惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤表達存在差異，提示S100P與胎盤滋養(yǎng)細胞的功能可能存在一定的關(guān)系，但具體作用與可能的分子機制還有待進一步驗證。
　　第二部分 S100P對滋養(yǎng)細胞生物學功能的影響及分子機制探討
　

8、　目的:
　　探討S100P對滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響及可能的分子機制。
　　方法:
　　體外細胞實驗部分:培養(yǎng)JAR和JEG-3滋養(yǎng)細胞系，構(gòu)建真核表達載體和小干擾RNA分別轉(zhuǎn)染JAR細胞和JEG-3細胞。不同分組滋養(yǎng)細胞分別用XTT細胞生長實驗、細胞凋亡實驗、平板克隆形成實驗及transwell細胞遷移實驗分析S100P對滋養(yǎng)細胞生長、凋亡、克隆形成及遷移能力的影響。體內(nèi)動物實驗部分:應(yīng)用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗和尾靜脈注

9、射轉(zhuǎn)移瘤實驗觀察S100P對滋養(yǎng)細胞體內(nèi)成瘤能力和細胞轉(zhuǎn)移能力的影響。為了進一步探討S100P的作用機制，我們用western-blot檢測P38信號通路相關(guān)分子在JAR細胞中的作用。
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建S100P真核表達載體和S100P小干擾RNA（siRNA1、siRNA2），轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細胞系JAR和JEG-3。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達S100P的JAR和JEG-3細胞均比對照組（空載體轉(zhuǎn)染組）細胞生長能力增快，細胞克隆形成

10、能力增加，且細胞體外遷移能力亦明顯增加(P＜0.05)。與之相反，轉(zhuǎn)染小干擾RNA的滋養(yǎng)細胞生長能力要明顯慢于對照組，且細胞克隆形成能力降低，體外遷移能力也降低(P＜0.05)。
　　(2)我們接著檢測上調(diào)S100P的表達水平對裸鼠體內(nèi)成瘤能力和尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤形成的影響，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組細胞相比，S100P過表達滋養(yǎng)細胞形成的腫瘤體積明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時，轉(zhuǎn)移瘤實驗顯示S100P過

11、表達組JAR細胞在裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力顯著增強(P＜0.05)。
　　(3)進一步分子機制實驗結(jié)果顯示S100P過表達后滋養(yǎng)細胞JAR的P-P38和P-ERK表達升高;利用抑制劑SB203580阻斷P38 MAPK，上調(diào)S100P的表達不能促進JAR細胞的增殖作用，而ERK通路抑制劑PD98059阻斷后對S100P引起的細胞增殖沒有作用。
　　結(jié)論:
　　S100P可以促進滋養(yǎng)細胞的體外增殖、克隆、遷移能力以及體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)