妊高征患者胎盤(pán)組織差異表達(dá)基因的篩選與確定.pdf

1、妊娠高血壓綜合癥(pregnancy-induced hypertension,PIH)是圍產(chǎn)期母嬰死亡的主要原因之一.在人類(lèi)基因組計(jì)劃完成后,疾病基因組計(jì)劃及其相關(guān)的表達(dá)遺傳學(xué)研究已經(jīng)啟動(dòng),并成為當(dāng)今分子醫(yī)學(xué)研究的主要內(nèi)容之一.妊高征胎盤(pán)與正常胎盤(pán)相比,在基因表達(dá)方面有哪些差異?基因表達(dá)的差異與妊高征的臨床表現(xiàn)有何聯(lián)系?差異基因表達(dá)的產(chǎn)物能否在蛋白水平上分子水平保持一致?為了了解這些差別,同時(shí)為了證實(shí)這些差別在大范圍妊高征病人中具有普

2、遍的意義,我們進(jìn)行了以下研究:1妊高征病人數(shù)據(jù)庫(kù)的建立(construction of PIH database); 2組織芯片的制備,在每張組織切片上選2-3個(gè)不同的的視野,以組織直徑為3mm,間距1mm制作胎盤(pán)組織芯片.3抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)在妊高征病人數(shù)據(jù)庫(kù)中選取年齡、孕周、手術(shù)終止妊娠時(shí)間相近的2例重度妊高征病人胎盤(pán)組織提取總RNA.考慮到胎兒表型對(duì)結(jié)

3、果的影響,2例病人分娩的胎兒性別不同.變性凝膠電泳顯示RNA質(zhì)量滿意后將2例病人胎盤(pán)組織總RNA等量混合,作為tester. 4基因克隆; 用Premega公司的T-Aeasy Kit克隆妊高征胎盤(pán)組織cDNA文庫(kù)基因. 5反向點(diǎn)雜交;將轉(zhuǎn)化菌鋪板,隨機(jī)挑選384個(gè)白色菌落,搖菌;以菌液為模板,PCR擴(kuò)增目的片段,用PCR產(chǎn)物點(diǎn)膜,分別用正向、反向消減的擴(kuò)增后cDNA文庫(kù)制備P<'32>標(biāo)記探針.反向探針與正向探針在同一條件下與所選菌落

4、雜交.比較雜交信號(hào)值,選信號(hào)值差別大于3的菌落測(cè)序.6DNA序列測(cè)定;將所選的cDNA片段用T7法測(cè)序.將所測(cè)序列進(jìn)行BLASTN同源分析,以同源性大于95﹪為標(biāo)準(zhǔn),初步確定候選差異表達(dá)基因.8選取4例妊高征病人胎盤(pán)和4例正常孕婦胎盤(pán).將4例正常胎盤(pán)組織總RNA等量混合作為整體對(duì)照,利用上海聯(lián)合基因公司生產(chǎn)的4000點(diǎn)cDNA表達(dá)譜芯片檢查妊高征胎盤(pán)差異表達(dá)基因.9反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR);根據(jù)初步篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因,用R