大鼠佐劑關節(jié)炎模型CCR5基因干擾治療的研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(RA)是一個累及周圍關節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫疾病，其病理為慢性滑膜炎，侵及下層的軟骨和骨，造成關節(jié)破壞，RA的病因至今不明，目前也尚無特效治療手段。T、B淋巴細胞，尤其是CD4+T淋巴細胞引發(fā)的滑膜巨噬細胞和成纖維細胞的過度激活和增殖是RA病變形成的最重要細胞學基礎。在RA的病變滑膜，可以看到大量T淋巴細胞圍繞新生血管分布及由T、B淋巴細胞組成的類似淋巴結的結構。這種病理性淋巴細胞的聚集是病變關節(jié)滑膜炎形成的關鍵

2、因素，而在這種炎性細胞的定向趨化和聚集過程中，趨化因子受體及其配體發(fā)揮著極其重要的作用。
　　趨化因子(Chemokine)是一類含70～90個氨基酸殘基的分泌型細胞因子。根據其分子內特定半胱氨酸的數量及位置可分為CXC、CC、C、CX3C四個亞族，趨化因子具有激活各類白細胞，促進其游走聚集，引起炎癥反應的功能，趨化因子受體5(CCR5)是CC亞族趨化因子MIP-1a（巨噬細胞炎性蛋白-1 a）、MIP-1β和RANTES（正常T

3、細胞活化后表達和分泌的調節(jié)蛋白）的特異性受體。在已知的趨化因子受體中，CCR5及其配體RANTES及MIP-1在RA的病理形成過程中具有重要意義。在人類RA患者及RA模型鼠的滑膜組織，CCR5的表達均較正常對照顯著增強，且其配體的表達也明顯提高。相關研究說明CCR5及其配體作用經路在RA滑膜炎性細胞趨化和浸潤過程中扮演重要角色，尋找一種真正可以用于臨床的抑制CCR5表達的方法是一項非常有意義的工作。
　　RNA干擾技術（RNA i

4、nterfering，RNAi）是利用生物進化過程中保存下來的一種mRNA表達抑制機制，人工引入互補的小干擾RNA，最終實現目的基因表達抑制-即基因沉默(gene silencing)的技術。該技術具有效率高，靶向性強等特點。目前，RNAi技術已被廣泛地應用于基因功能鑒定、惡性腫瘤、病毒性肝炎及艾滋病治療等多個醫(yī)學領域。作為HIV病毒感染人CD4+巨噬細胞的必須協(xié)同受體，利用RNAi技術抑制CCR5表達的工作在艾滋病領域得到了深入研究，

5、并顯示了很好的臨床應用前景。而在RA領域，目前尚無應用RNAi抑制CCR5表達的研究，我們將通過體外研究構建大鼠CCR5 mRNA的siRNA表達質粒，并通過293T工具細胞篩選出特異性質粒，采用大鼠佐劑關節(jié)炎模型，通過在體電穿孔的方法進行RNA干擾，抑制其CCR5 mRNA的表達，以明確該方法的有效性和安全性，從而為RA的治療探尋一種有效的新的治療方法。
　　方法:
　　1、根據靶基因設計原則設計并構建大鼠CCR5 siR

6、NA表達質粒及CCR5過表達質粒，利用脂質體轉染法共轉染293T細胞，應用Westemblot檢測rCCR5蛋白表達水平， real time PCR檢測rCCR5 mRNA表達水平，篩選出特異性CCR5 siRNA表達質粒。
　　2、建立AIA大鼠模型，電穿孔法進行動物在體的CCR5 siRNA質粒轉染，熒光顯微鏡觀察轉染位置及效果。臨床觀察大鼠一般情況、關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎指數及關節(jié)滑膜病理評分，Western Blot及rea

7、l time PCR分析CCR5蛋白及mRNA表達的情況，評估CCR5基因治療效果。
　　結果:
　　1、各組質粒共轉染293T細胞后，在倒置熒光顯微鏡下見到細胞內發(fā)出均勻明亮的綠色熒光。轉染后24小時，熒光顯微鏡下觀察，表達EGFP的陽性細胞百分比，67±3.2％。
　　2、293T細胞共轉染后36小時檢測CCR5蛋白及mRNA表達水平，D1質粒相比其它3組質粒及NC質粒對CCR5的干擾抑制作用最強，(P＜0.01)

8、，為有效篩選靶點。
　　3、動態(tài)觀察Wistar大鼠轉染后1～5天，轉染后1天可以看到EGFP蛋白的表達，表達強度隨著時間逐漸增高，3天時達高峰，之后EGFP的表達隨時間的延長而逐漸減低，而在對側未干擾關節(jié)未發(fā)現熒光的表達。
　　4、Wistar大鼠FCA免疫后7天起出現部分大鼠關節(jié)紅腫，第14～18天FCA組大鼠100％出現關節(jié)紅腫，第28天達最高峰。CCR5 RNA干擾治療后AIA大鼠體重下降程度及關節(jié)炎指數改善，左側關

9、節(jié)腫脹度明顯改善。
　　5、CCR5 RNA干擾治療后AIA大鼠局部滑膜病理學評分明顯改善(P＜0.05)對側未觀察到改善。
　　6、CCR5 RNA干擾治療后滑膜CCR5蛋白及mRNA表達均明顯降低(P＜0.01)
　　結論:
　　1、D1 siRNA組與未轉染對照組、陰性序列對照組、其它siRNA組比較，能有效抑制大鼠CCR5的蛋白表達。
　　2、D1 siRNA組與未轉染對照組、過表達CCR5質粒組、

10、陰性序列對照組比較，能有效抑制大鼠CCR5 mRNA表達。
　　3、D1 siRNA針對大鼠CCR5 mRNA的靶序列為CAGGGATCTATCACATTGGTT。
　　4、CCR5 RNA干擾治療可以改善AIA大鼠的臨床癥狀及關節(jié)炎指數，明顯改善AIA大鼠的局部關節(jié)腫脹度。
　　5、CCR5 RNA干擾治療可以明顯改善AIA大鼠局部關節(jié)的病理過程。
　　6、CCR5 RNA干擾治療主要作用于局部關節(jié)，對對側及雙