人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子(hTERTpromoter)介導的ODC、SAMDC反義腺病毒的構建及其靶向抗腫瘤研究.pdf

1、多胺廣泛存在于生物體內(nèi)的各組織細胞中，是重要的代謝調(diào)控物質(zhì)。在腫瘤組織中多胺的含量明顯升高。鳥氨酸脫羧酶是多胺生物合成的第一個關鍵酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
　　 抑制多胺代謝途徑成為治療腫瘤的有效途徑。相應的化學抑制劑如二氟甲基鳥氨酸、APA、CGP48664和AMA雖然在體內(nèi)外的抑癌作用良好，但其嚴重的毒副作用極大的防礙了臨床應用。
　　 尋找一種更高效更低副作用的抑制多胺合成途徑的方法勢在必行。如今，美

2、國已啟動600多個基因治療的臨床實驗，其中60％是關于癌癥治療的。其中腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)染途徑在癌癥的基因治療中特別引人關注，因為腺病毒的DNA不能整合到宿主基因組中，也不能感染卵細胞，具有很高的生物安全性。
　　 國內(nèi)外研究證明反義核酸技術是比較理想的一種基因治療方法，構建能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組載體在細胞內(nèi)不斷地轉(zhuǎn)錄出反義RNA，抵消酶解作用，發(fā)揮較持久的治療效應。
　　 基因治療在當今臨床已經(jīng)產(chǎn)生令人振奮的研究結果，

3、但它的靶向安全性仍然是人們關注的焦點。許多腫瘤組織特異性啟動子已被人類所認識，hTERT基因啟動子更是備受關注。體外轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛蟹謩e采用hTERT啟動子與CMV啟動子來轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細胞系，包括人肺癌細胞系，結腸癌細胞系，人宮頸癌細胞Hela及兩種正常細胞系。
　　 據(jù)此，本課題擬將ODC、SAMDC的反義基因分別構建入pAdEasyl系統(tǒng)，由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子啟動表達，檢測重組病毒對腫瘤細胞的特異抑制作用，為腫瘤疾病的靶向

4、性基因治療奠定基礎。
　　 第一部分細胞端粒酶活性檢測及外源hTERT啟動子活性檢測
　　 研究目的：
　　 檢測本實驗中擬使用的五株細胞中端粒酶的活性，并檢測端粒酶催化亞基啟動子在腫瘤細胞系和正常細胞系中的啟動活性，為下一步人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子啟動的ODC、SAMDC反義病毒載體的構建奠定基礎。
　　 研究方法：
　　 (1)體外穩(wěn)定培養(yǎng)腫瘤細胞系及正常細胞系。
　　 (2)提取各株細

5、胞端粒酶蛋白，利用TRAP法進行端粒酶活性的檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果。即將10μlTRAP產(chǎn)物與含溴酚藍的6×凝膠載樣緩沖液2μl混合，在120V的電壓下，進行12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，直至電流使溴酚藍色帶泳出凝膠為止。固定銀染顯色后，出現(xiàn)4條以上間隔6bp的梯度條帶者為端粒酶活性陽性。
　　 (3)將帶有由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子啟動的指示基因luc的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入各株培養(yǎng)細胞。
　　 (4)通過雙熒光素酶

6、法檢測指示基因luc的表達活性，從而反映hTERT啟動子在腫瘤細胞和正常細胞中的啟動活性。
　　 實驗結果：
　　 (1)利用TRAP法進行端粒酶活性的檢測，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測顯示:對于腫瘤細胞系，均具有大于4條以上的陽性帶;而對于正常細胞系，均未見陽性條帶出現(xiàn)。
　　 (2)雙熒光素酶法檢測結果顯示，在腫瘤細胞系中，hTERT啟動子的比活性分別是:A549細胞為4.5±0.25;Bel-7402細胞為5.

7、1±0.24;HepG2細胞為4.9±0.3。而在正常細胞中，hTERT啟動子的比活性分別是:HELF細胞為0.16±0.02;L02細胞為O.11±0.01。
　　 結論：
　　 本實驗中擬使用的三株腫瘤細胞，其端粒酶活性為陽性;而對應的兩株正常細胞(HELF和L02)，其端粒酶活性為陰性。熒光素酶活性檢測顯示:hTERT啟動子在腫瘤細胞中具有較強啟動活性而在正常細胞中未見有明顯活性。
　　 第二部分 hTER

8、T啟動子介導的人ODC、SAMDC反義腺病毒載體的構建
　　 研究目的：
　　 分別構建由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp介導ODC和SAMDC反義RNA表達的腺病毒載體，為在腫瘤細胞中靶向性抑制多胺合成提供新工具和手段。
　　 研究方法：
　　 (1)應用PCR方法擴增出ODC mRNA翻譯起始位點區(qū)120bp的基因片斷，和SAMDC mRNA翻譯起始位點區(qū)205bp的基因片斷。PCR擴增產(chǎn)物和帶有h

9、TERT啟動子的質(zhì)粒pGL3-hTERT-luc均經(jīng)XbaI、NcoI雙酶切，回收質(zhì)粒酶切長片段和PCR酶切產(chǎn)物片段。
　　 (2)將ODC和SAMDC回收片段分別與pGL3-hTERT-luc酶切長片段進行連接，分別構成了pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重組質(zhì)粒。
　　 (3)KpnI和SalI雙酶切pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重組質(zhì)粒，回收短片段與經(jīng)Kp

10、nI和SalI雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack長片段連接。分別構成pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重組質(zhì)粒。
　　 (4)重組質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切線性化后，轉(zhuǎn)入Adeasy-1細菌與pAdeasy-1質(zhì)粒發(fā)生同源重組。挑選陽性重組質(zhì)粒pAdeasy-hTERT-ODC和pAdeasy-hTERT-SAMDC，經(jīng)PacI酶切后，轉(zhuǎn)染293細胞包裝和擴增出腺病毒顆粒。熒光顯微鏡和PC

11、R的方法對重組腺病毒進行鑒定。
　　 實驗結果：
　　 (1)采用PCR方法擴增出120bp、205bp的ODC、SAMDC基因片斷，經(jīng)電泳鑒定正確。
　　 (2)pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI、NcoI雙酶切分別得到120bp、205bp小片段和4.5kb大片段，經(jīng)測序鑒定正確。
　　 (3)pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTE

12、RT-SAMDC重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增分別得到長120bp的ODC片斷和長205bp的SAMDC片斷，經(jīng)測序鑒定此序列正確。
　　 (4)重組質(zhì)粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分別經(jīng)PacⅠ酶切得4.5kb和35kb兩個片段。
　　 (5)重組質(zhì)粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分別轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝擴增，可見明顯病毒空斑形成，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白在293細

13、胞中表達。擴增后腺病毒滴度為2×109pfu/ml，PCR證實兩個重組質(zhì)?；蚪M中分別含有目的基因ODC和SAMDC。
　　 結論：
　　 成功構建了由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERTp介導ODC反義RNA表達的腺病毒載體rAd-hTERT-ODC和SAMDC反義RNA表達的腺病毒載體rAd-hTERT-SAMDC，為腫瘤疾病的靶向性基因治療和預防提供了必要的侯備工具。
　　 第三部分兩組反義腺病毒載體靶向性抑制

14、腫瘤細胞增殖作用的研究
　　 研究目的：
　　 研究兩組重組腺病毒rAd-hTERT-ODC/SAMDC對五株細胞中ODC、SAMDC基因表達的下調(diào)作用，并觀察其對腫瘤細胞增殖以及侵襲能力的靶向抑制作用。
　　 研究方法：
　　 (1)將兩組重組腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染入上述五株細胞，通過MTS法測定不同MOI的腺病毒對各株細胞的轉(zhuǎn)染效率，以找到不同細胞的最適感染滴度。rAd-hTERT-ODC/SAMDC分別

15、以最適感染滴度感染人肺癌細胞系A549、人肝癌細胞系Bel-7402、HepG2及正常細胞系人胚肺成纖維細胞HELF、人肝細胞L02。
　　 (2)采用Western-blot技術檢測重組腺病毒感染細胞后，ODC和SAMDC蛋白表達情況。
　　 (3)采用MTS實驗檢測重組腺病毒對各株細胞增殖的抑制作用。
　　 (4)采用流式細胞術檢測重組腺病毒對各細胞周期分布的影響。
　　 (5)采用Matrigel侵

16、襲實驗分析重組腺病毒對腫瘤細胞侵襲活性的影響。
　　 實驗結果：
　　 (1)腺病毒對A549細胞的最適感染滴度為50MOI，對其它細胞為25MOI。分別以該MOI的重組腺病毒感染A549、Bel-7402和HepG2腫瘤細胞可明顯抑制其生長增殖，最大抑制率分別為65％、62％和55％;但對HELF和L02正常細胞抑制生長作用不明顯。
　　 (2)腺病毒感染腫瘤細胞后，可明顯抑制ODC和SAMDC基因表達。rAd

17、-hTERT-ODC對A549、Bel-7402和HepG2腫瘤細胞中ODC的抑制分別達50％、60％、50％，rAd-hTERT-SAMDC對SAMDC的抑制可達40％、50％、40％。兩種重組腺病毒對正常細胞內(nèi)的ODC和SAMDC均未見有明顯抑制作用。
　　 (3)流式細胞DNA含量分析顯示，兩種重組腺病毒可引起腫瘤細胞周期阻滯于G0-G1期，但并未引起明顯凋亡。對于正常細胞，rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-

18、SAMDC組與rAd-GFP組、PBS組未見明顯改變。
　　 (4)Matrigel侵襲實驗顯示，重組腺病毒可顯著抑制體外腫瘤細胞的侵襲能力。
　　 結論：
　　 兩組重組腺病毒rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC分別能有效抑制腫瘤細胞中ODC和SAMDC基因的表達，使細胞周期阻滯于G0-G1期，抑制腫瘤細胞的增殖活性，并明顯抑制腫瘤細胞的侵襲活力。而對于正常細胞卻沒有明顯抑制作用。從而初步