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文檔簡介
1、目的:近年來,乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢,發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位,對世界女性健康造成嚴(yán)重威脅。血管新生過程是腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抗血管新生治療也廣泛應(yīng)用于臨床,抗血管生成藥物日新月異。Y盒結(jié)合蛋-1(Y-box binding protein-1,YB-1)作為體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,在包括基因轉(zhuǎn)錄、RNA剪切及mRNA翻譯、DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖等多個過程中均發(fā)揮重要作用,并在肺癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá),并與腫
2、瘤增殖、耐藥密切相關(guān),且有研究表明其可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,但其調(diào)節(jié)腫瘤血管新生的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究通過構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體,并用腺病毒液感染EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞旨在探究冷休克蛋白家族成員YB-1蛋白C末端結(jié)構(gòu)域(YB-1 C-terminal domain,YB-1 CTD)對血管新生的調(diào)節(jié)機(jī)制,為抗血管新生靶向治療提供理論依據(jù)。
方法:構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體,用GFP和GFP-YB-1 CTD腺病毒液感染EA.hy
3、926內(nèi)皮細(xì)胞,MTS法檢測GFP和GFP-YB-1 CTD對細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測YB-1 CTD對細(xì)胞周期的影響;Western blot檢測YB-1 CTD對EA.hy926細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、cyclin B1的表達(dá)水平的調(diào)節(jié);RT-PCR檢測YB-1 CTD對p21、cyclin B1 mRNA表達(dá)的影響;跨膜遷移實驗評價YB-1 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響;血管內(nèi)皮成環(huán)實驗檢測YB-1
4、 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞血管成環(huán)特性的影響;ELISA檢測YB-1CTD對SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞分泌VEGF的調(diào)節(jié);檢測細(xì)胞骨架染色觀察YB-1CTD對EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的分布及狀態(tài)的影響。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)± s)表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果: MTS法檢測細(xì)胞增殖顯
5、示,轉(zhuǎn)染GFP-YB-1 CTD48小時后,EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞增殖均受到抑制;流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測細(xì)胞周期結(jié)果提示YB-1 CTD可調(diào)節(jié)EA.hy926細(xì)胞周期阻滯在G1期;Western blot免疫印跡分析顯示與GFP對照組相比,GFP-YB-1 CTD能上調(diào)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)水平,并下調(diào)cyclin B1蛋白的表達(dá)水平;實時定量PCR結(jié)果提示,在mRNA水平,YB-1CTD
6、促進(jìn)p21的表達(dá),而抑制cyclin B1的表達(dá);跨膜遷移實驗可見GFP組較GFP-YB-1 CTD組跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)多;鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色觀察到GFP組EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中含有大量平行束狀分布的應(yīng)力纖維,且纖維粗大,沿細(xì)胞長軸分布,GFP-YB-1 CTD組,未見明顯的纖維束,微絲解聚并且彌散地分布于胞質(zhì)中,血管內(nèi)皮成環(huán)實驗結(jié)果顯示,在40倍顯微鏡下,GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多,血管環(huán)完整,在Metrigel膠表面較均勻分布,
7、延長培養(yǎng)時間血管環(huán)穩(wěn)定,不易破碎,GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮細(xì)胞不易成環(huán),或者部分成環(huán),血管環(huán)不完整,成條索狀結(jié)構(gòu);在100倍顯微鏡下觀察GFP組能明顯觀察到EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞伸展、延長,相鄰的細(xì)胞可以連接呈環(huán)狀。GFP-YB-1 CTD組EA.hy926血管內(nèi)皮細(xì)胞部分伸展,部分呈球狀,僅有少數(shù)細(xì)胞可以產(chǎn)生相互連接,形成類似于“肝索”樣的細(xì)胞條索,而不是完整的血管環(huán)。ELISA法檢測SK-BR-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的VEG
8、F含量結(jié)果顯示,與GFP對照組相比,GFP-YB-1 CTD組條件培養(yǎng)基中VEGF含量低。SK-BR-3細(xì)胞條件培養(yǎng)基刺激條件下的血管成環(huán)結(jié)果顯示,GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多、血管環(huán)完整、周長較長,延長培養(yǎng)時間,血管環(huán)穩(wěn)定,GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮幾乎不成環(huán)或者少數(shù)成環(huán),成環(huán)局限、不完整且不穩(wěn)定易破碎。
結(jié)論: YB-1 CTD抑制EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞及SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞增殖,影響EA.hy926遷移和成環(huán)能力
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